Modelo de soporte de peso libre de tensión de osteonecrosis de la cabeza femoral inducida por esteroides en ratas

Resumen

El protocolo muestra la construcción de un modelo de entrenamiento simple y rentable con soporte de peso en ratas para la osteonecrosis de la cabeza femoral inducida por esteroides utilizando cinta terapéutica elástica.

Resumen

A diferencia de los humanos, las ratas son animales que caminan a cuatro patas, mientras que los humanos son animales bípedos que están de pie, y las caderas están sometidas a una tremenda presión al caminar y estar de pie. En los modelos de necrosis de la cabeza femoral inducida por esteroides en ratas, a menudo es necesario simular las características biomecánicas de la cadera humana bajo una presión más alta. Algunos eruditos intentan emular el estado de presión de la cadera humana haciendo que las ratas soporten un cierto peso, pero fijar el objeto que soporta el peso en la rata es difícil. Las ratas pueden liberarse fácilmente de la inmovilización, y pegar el peso sobre las ratas con cinta adhesiva hará que las ratas se asfixien o mueran por obstrucción intestinal. Nuestro grupo de investigación utilizó cinta terapéutica elástica para realizar la inmovilización sin tensión de objetos que soportan peso en ratas, de modo que las ratas pudieran respirar libremente y no se desprendieran de la inmovilización en condiciones de soporte de peso. En comparación con el modelo habitual de rata con necrosis de la cabeza femoral inducida por esteroides, encontramos que esta intervención de soporte de peso puede agravar la progresión de la necrosis de la cabeza femoral en ratas.

Introducción

La administración de glucocorticoides es el factor de riesgo más frecuente para la osteonecrosis no traumática de la cabeza femoral (ONFH)¹. Numerosas evidencias sugieren que, además de los glucocorticoides, la carga de presión sobre la articulación de la cadera en los pacientes también se asocia con la aparición de ONFH. Factores como el peso corporal y la intensidad física del trabajo son reconocidos como factores de riesgo para la ONFH². Múltiples estudios clínicos han demostrado una estrecha relación entre las condiciones de carga articular de la cadera y el momento y la incidencia del reemplazo articular 3,4,5,6. Por lo tanto, es importante establecer un modelo que refleje la relación entre la carga y la osteonecrosis de la cabeza femoral inducida por esteroides (SONFH) para una investigación exhaustiva de esta afección.

Las aves bípedas grandes, como los avestruces y los emúes, sirven como buenos modelos para simular el estrés de la articulación de la cadera, asemejándose a las cargas de las piernas humanas ^7,8. Sin embargo, el mantenimiento de grandes especies de aves es un desafío y los costos de investigación asociados son altos. Los modelos de ratas espontáneamente hipertensas ^9,10 pueden presentar tasas más altas de ONFH, pero la carga de presión del compartimento en la médula generada por la hipertensión espontánea difiere significativamente de la presión mecánica y no es adecuada para estudiar el impacto de la presión mecánica sobre la SONFH.

Los modelos de animales pequeños se utilizan habitualmente en la investigación sobre SONFH. Sin embargo, los reptiles cuadrúpedos tienen una menor tensión en las articulaciones de la cadera, y sus modelos de cadera no pueden simular el entorno biomecánico de las articulaciones de la cadera humana durante la marcha bípeda. Los modelos¹¹ de inmovilización de una sola extremidad y los modelos¹² de descarga parcial son comunes, pero ambos reducen la carga de la extremidad. Dado que los seres humanos son organismos bípedos con cargas sustanciales en las extremidades inferiores mientras están de pie y caminan, la reducción de la carga en estos modelos disminuye la conexión entre los modelos animales y las enfermedades humanas.

Este estudio tiene como objetivo establecer un modelo simple y rentable para el entrenamiento con peso para investigar el impacto del entrenamiento con peso en la osteonecrosis inducida por esteroides de la cabeza femoral en ratas. En la actualidad, se han utilizado modelos de rata para estudiar la osteonecrosis de la cabeza femoral inducida por esteroides^13,14, pero todavía no existe un modelo que pueda proporcionar una fijación segura a largo plazo con una interrupción mínima del movimiento, que además es relativamente simple y económica. En este estudio, se aplica un material de fijación de alta adherencia, adoptando una fijación libre de tensión, que mantiene la movilidad de las ratas y reduce el sufrimiento e incluso la muerte causados por una fijación inadecuada.

Protocolo

El protocolo se adhiere a las pautas éticas establecidas por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Medicina China de Beijing, número de protocolo BUCM-4-2022062001-2109. El protocolo utiliza ratas Sprague Dawley (SD) (SCXK(Jing)2019-0008), de 8-10 semanas de edad y con un peso de 200 g-250 g.

1. Entrenamiento de adaptación

1. Las ratas albinas generalmente tienen un alcance visual de menos de 60 cm¹⁵. Durante el proceso de modelado, coloque a las ratas en jaulas opacas y manténgalas lo más lejos posible de las ratas no modeladas (al menos, otras ratas deben estar fuera del alcance visual máximo de las ratas modeladas) para evitar que experimenten estrés traumático.
2. Encienda la alimentación y ajuste la cinta de correr a 10 m/min con una inclinación de 0°. Coloque las ratas en la cinta de correr y asegúrese de que los movimientos sean lo más suaves posible para evitar el estrés. No utilice estimulación adicional; Las ratas se arrastrarán naturalmente hacia adelante porque no están familiarizadas con el entorno.
3. El entrenamiento tiene una duración de 15 min. Después del entrenamiento, limpie las heces y la orina dejadas por las ratas y rocíe alcohol para eliminar el olor animal. Luego, prepara a la próxima rata para el entrenamiento.
   NOTA: Si una rata se niega a caminar en la caminadora durante 5 minutos, exclúyala del estudio.
4. Continuar con el entrenamiento adaptativo hasta el final de la^1ª semana.

2. Medición de la capacidad máxima de carga de peso en ratas

1. Prepare dos tubos de ensayo, un gancho y un cierre de bucle de aproximadamente 80 cm de largo. Coloque las bolas de acero en los tubos de ensayo, asegurándose de que el peso combinado inicial de los tubos de ensayo, el gancho y el sujetador de bucle sea de 150 g. Prepare tubos de ensayo con diferentes pesos totales en incrementos de 10 g, siendo el peso máximo de 350 g.
2. Un investigador usa ambas manos para sujetar ratas con guantes (Figura 1). Otro investigador coloca el tubo de ensayo en la espalda de la rata a aproximadamente 1 cm de la línea media de la espalda. Dado que este paso no requiere el movimiento de la rata, realice la fijación simplemente envolviendo el cierre de velcro alrededor de la rata sin usar medidas adicionales para asegurar el tubo.
3. Cambie el tubo hasta alcanzar el peso máximo de la rata. Cuando la rata alcanza su máxima capacidad de soporte, no puede ponerse de pie cuando se le pincha o cuando el experimentador se va. Reduzca el peso en 10 g para permitir que la rata se ponga de pie. Este peso representa la capacidad máxima de carga de peso de la rata.

3. Preparación de la carga de peso

1. Dado que se requiere una fijación segura durante el entrenamiento, asegure los objetos con cinta terapéutica elástica de 1-1,5 m basada en el tamaño de la rata, que tenga una fuerte adherencia. Use arcilla para ajustar el peso de los tubos de ensayo para reducir el balanceo de la carga.
2. Después de pesar el peso de los tubos de ensayo y los objetos de fijación, agregue una cantidad adecuada de arcilla en los tubos de ensayo para ajustarlos al peso objetivo. Use una varilla de vidrio para esparcir uniformemente la arcilla dentro de los tubos de ensayo. La arcilla concentrada en un extremo del tubo de ensayo puede hacer que se desprenda fácilmente durante el entrenamiento.
3. Ajuste el peso total de los tubos de ensayo ajustados y la arcilla al 50% de la capacidad máxima de carga de peso de la rata (Figura 1A). Exceder este peso dificultará que la rata complete el entrenamiento. No vuelva a ajustar el peso de la carga hasta el final del experimento.

4. Establecimiento de la osteonecrosis inducida por esteroides del modelo de cabeza femoral

1. Utilice el método de metilprednisolona combinada con lipopolisacárido (LPS+MPS) para el establecimiento del modelo SONFH ^16,17. Realizar la inyección intraperitoneal de LPS (20 μg/kg) utilizando una aguja estándar en la línea media del abdomen de la rata una vez cada 24 h, para un total de 2 inyecciones.
2. Después de la última inyección de LPS, inyecte MPS (40 mg/kg) en el músculo glúteo unilateral 24 h después de la alimentación regular y continúe las inyecciones cada 24 h, alternando entre las dos áreas glúteas, para un total de tres inyecciones.

5. Inmovilización con soporte de peso sin tensión mediante cinta terapéutica elástica y entrenamiento en cinta rodante

1. Marque la línea media del dorso de la rata a 1-2 cm en ambos lados; Este es el punto de referencia para la carga de peso. Asegúrese de que las marcas estén colocadas correctamente para evitar que la rata se incline o dificulte el movimiento durante el entrenamiento en la caminadora.
2. Con un investigador fijando a la rata con guantes, coloque una mano debajo de la axila de la rata para asegurar la extremidad delantera y la mandíbula mientras que la otra mano asegura las extremidades traseras y la cola. Evite la fuerza excesiva para evitar el estrés o la asfixia (Figura 1B).
3. Adherir la cinta terapéutica elástica al tubo de ensayo sin aplicar tensión para asegurar la carga en la espalda de la rata. En el proceso de enrollado, no estire la cinta terapéutica elástica para lograr una fijación sin tensión.
   NOTA: La cinta terapéutica elástica utilizada en este modelo está diseñada para el vendaje durante actividades físicas intensas, proporcionando una alta adherencia y elasticidad¹⁸. Debido a su alta elasticidad, reduce en gran medida el impacto en el movimiento de la rata mientras se arrastra.
4. Pida al segundo investigador que fije el tubo de ensayo a la espalda de la rata paralelo a la columna vertebral de la rata, con la posición de fijación basada en las marcas hechas, es decir, a 1-2 cm de distancia de la línea media a ambos lados de la espalda de la rata.
5. Para minimizar el sufrimiento de la rata, reducir el impacto en el movimiento de la rata y disminuir la mortalidad causada por la fijación, realice la fijación sin aplicar tensión. Pega el tubo de ensayo con peso ajustado sobre la cinta terapéutica elástica, luego envuelve el tubo de ensayo alrededor del cuerpo de la rata usando una técnica sin tensión.
6. Asegure una inmovilización sin tensión y mantenga la longitud original de la cinta terapéutica elástica sin estirarla para evitar efectos adversos sobre la respiración y el movimiento de las ratas (Figura 1C).
7. Después de envolver el tubo de ensayo alrededor del cuerpo de la rata, colócala en un espacio abierto o en una jaula individual, monitoreando su respiración y dirección. Si aparecen signos de respiración rápida o apertura de la boca, suelte rápidamente a la rata para evitar la asfixia.
   1. La inmovilización ideal permite que la rata se mueva libremente y realice actividades como beber, levantar las extremidades delanteras y alimentarse (Figura 1D). Si la inmovilización no es satisfactoria, suéltelo temporalmente y vuelva a inmovilizarlo después de 20 minutos para minimizar el estrés en la rata debido a los estímulos repetidos de inmovilización.
8. Encienda la alimentación y ajuste la cinta de correr a 1 m/min con una inclinación de 0°. El tiempo de entrenamiento en cinta es de 30 min. Transfiera suavemente la rata a la caminadora y comience el temporizador.
9. No proporcione estimulación adicional a la rata. Si la rata no puede completar el entrenamiento de 30 minutos, colóquela en una jaula para un descanso de 10 minutos sin quitar la fijación.
   NOTA: La cinta terapéutica elástica utilizada en este estudio tiene una excelente elasticidad y adhesividad. Cuando se asegura correctamente sin tensión, la fijación a largo plazo no hará que el tubo de ensayo se desprenda ni provocará la asfixia y la muerte de la rata.
10. Después del entrenamiento, limpie las heces y la orina dejadas por las ratas y rocíe alcohol para eliminar el olor animal.
11. Evite que otras ratas vean los pasos anteriores y manipule a los animales con la mayor suavidad posible para evitar que vocalicen, causando así estrés traumático a otras ratas.
12. Libere inmediatamente a la rata de la fijación después de completar el entrenamiento (Figura 1E). Durante la liberación, use los dedos para presionar el pelaje de la rata para protegerla, minimizando la pérdida de pelaje durante la liberación (Figura 1F).

6. Agrupamiento de animales

1. Para estudiar el impacto del entrenamiento con pesas en la SONFH, dividimos aleatoriamente 60 ratas en cuatro grupos.
2. En el grupo de control, no establezca el modelo de osteonecrosis común de la cabeza femoral inducida por esteroides (SONFH) ni realice entrenamiento con pesas. En el grupo Control+Carga, realice únicamente el entrenamiento con soporte de peso, sin establecer la osteonecrosis inducida por esteroides del modelo de cabeza femoral. En el grupo Modelo, establecer la osteonecrosis inducida por esteroides del modelo de cabeza femoral solamente. En el grupo Modelo+Carga, realice un entrenamiento con pesas después de establecer la osteonecrosis inducida por esteroides en el modelo de cabeza femoral.

7. Eutanasia y recogida de muestras

1. Coloque las ratas en una cámara de eutanasia para animales pequeños e inyecte suficiente dióxido de carbono para lograr una concentración superior al 5%. Una vez que las ratas pierdan el conocimiento, se administrará una dosis de 0,3 mL/kg de peso corporal de una solución de cloruro de potasio al 20%, con un total de 20 mL, mediante una inyección intracardíaca.
2. Monitoree la respiración y los latidos del corazón de las ratas para asegurarse de que no experimenten dolor ni molestias durante la eutanasia. Confirme la muerte comprobando la ausencia de respiración y latidos cardíacos. Rocía alcohol para limpiar cualquier olor.
3. Después de la eutanasia, diseccionar la región de la cadera de la rata y extraer la cabeza femoral mientras se mantiene el fémur intacto. Realice una microtomografía computarizada después del tratamiento previo, seguida de la tinción con hematoxilina-eosina (HE).

8. Tinción de hematoxilina-eosina

1. Una vez completado el modelado, practica la eutanasia a las ratas. Retire los fémures para la tinción de AE.
2. Remojar los fémures de rata en paraformaldehído al 4% durante 24 h para preservar los tejidos biológicos como muestras. Remoje las muestras de fémur de rata en ácido fórmico al 5% para su descalcificación durante 5 días.
3. Seccione las muestras en rodajas de 5 μm para la tinción HE.
   NOTA: Las lagunas vacías se refieren a la situación en el tejido óseo¹⁹ donde las lagunas, que normalmente deberían contener osteocitos, están desprovistas de estas células. Es un indicador importante para evaluar la salud del tejido óseo. En el proceso patológico de la necrosis ósea, un suministro insuficiente de sangre puede causar la muerte de los osteocitos, lo que conduce a lagunas vacías. En el diagnóstico y evaluación de la necrosis ósea, el número y la distribución de las lagunas vacías son parámetros importantes para medir la gravedad de la enfermedad^20,21.
   1. Coloque las muestras femorales de rata en parafina derretida (56-60 °C), primero remojándolas en parafina de bajo punto de fusión, si es necesario, luego transfiéralas gradualmente a parafina de mayor punto de fusión, cada vez durante aproximadamente 1 hora, para asegurar una infiltración completa del tejido con parafina.
   2. Prepare los moldes de inclusión y vierta la parafina derretida en los moldes hasta la profundidad adecuada. Recupere las muestras de tejido de la parafina con pinzas después de remojarlas, retire el exceso de parafina y colóquelas en moldes. Enfriar a temperatura ambiente para solidificar la parafina, formando bloques de parafina.
   3. Con un micrótomo de parafina, corte los bloques de parafina incrustados en secciones de 5 μm de grosor.
4. Hornee las muestras femorales de rata con rodajas adjuntas en un calentador deslizante durante 1 h para mejorar la adherencia entre las rodajas y el cubreobjetos y reducir la flotación durante los procesos de tinción posteriores.
5. Sumerja las rebanadas horneadas secuencialmente en xileno puro para eliminar la parafina, seguido de una serie de deshidratación a través de etanol absoluto, etanol de gradiente (100%, 95%, 80%, 70%) y agua, durante 2 minutos cada una, completando el proceso de desparafinación y rehidratación.
6. Sumerja las rodajas desparafinadas en una solución de tinción de hematoxilina y tiña durante 10 minutos. Enjuague con agua corriente para eliminar la hematoxilina no unida.
7. Sumerja las secciones teñidas con hematoxilina en una solución de tinción con eosina y tiña durante 2 minutos para colorear el citoplasma y el tejido conectivo. Enjuagar con una solución de ácido acético al 1% para fijar el efecto de las manchas.
8. Sumerja las rodajas de la muestra de hueso femoral de rata secuencialmente en etanol al 70%, 80%, 90%, 95% y 100%, con cada gradiente durante 2 minutos, eliminando gradualmente la humedad.
9. Sumerja las rodajas de la muestra de hueso femoral de rata en xileno puro para darle transparencia, seguido de un enjuague con agua corriente para eliminar el xileno. Aplique resina de montaje neutra, cubriendo las correderas, golpeando suavemente para eliminar las burbujas de aire y permitiendo que el medio de montaje se solidifique para completar el proceso de montaje.
10. Usando el paquete randomizr en R, seleccione 30 portaobjetos teñidos con HE para cada grupo y asigne 15 portaobjetos a cada uno de los dos investigadores. Sin informarles de las agrupaciones, pida a los investigadores que calculen la tasa de lagunas vacías de los portaobjetos y recopilen los resultados para el análisis estadístico.

9. Análisis de microCT

1. Una vez completado el modelado, practica la eutanasia a las ratas. Extirpar los fémures para la tinción con hematoxilina-eosina.
2. Remojar los fémures de rata en paraformaldehído al 4% durante 24 h para preservar los tejidos biológicos como muestras. Coloque los fémures de rata en el dispositivo microCT específico para animales pequeños.
3. Configure las condiciones de escaneo de microCT de la siguiente manera: Voltaje de rayos X: 80 kV, Corriente: 100 μA, Tiempo de exposición única: 50 ms, Resolución de escaneo: 25 μm. Realice exploraciones a intervalos de 0,5°, centrándose en el hueso trabecular desde debajo del cartílago hasta la parte superior de la epífisis como región de interés.
4. Defina el área por encima del cuello femoral de la rata como la región de interés.
5. Realice la reconstrucción del plano coronal de los resultados de la exploración con el dispositivo microCT y recopile las mediciones morfométricas óseas generadas por el software incorporado del dispositivo microCT. Registre los siguientes índices observados: Volumen total (TV), Porcentaje de volumen óseo (BV/TV), Relación superficie/volumen óseo (BS/BV), Espesor de la estructura (Tb.Th), Separación de la estructura (Tb.Sp), Número de hueso (Tb.N), Densidad ósea (BD).

10. Análisis estadístico

1. Presente los datos como la media ± la desviación estándar (DE). Realizar análisis estadísticos para micro-TC y evaluaciones histológicas cuantitativas utilizando la prueba t de muestra independiente. Considere un valor p < 0,05 como estadísticamente significativo.

Resultados

Análisis histopatológico
La tinción con hematoxilina y eosina reveló que en el grupo Control y en el grupo Control+Carga, las trabéculas óseas estaban intactas y dispuestas regularmente. Las células endoteliales de los vasos sanguíneos estaban presentes en los hoyuelos óseos y la morfología celular parecía regordeta. Por el contrario, el grupo Modelo y el grupo Modelo+Carga mostraron trabéculas óseas fracturadas y desordenadas, junto con un número signif...

Discusión

En la actualidad, varios animales, como los conejos²⁵, las ratas²⁶, los ratones²⁷, los cerdos²⁸, los pollos de engorde²⁹, los avestruces⁸ y los emúes³⁰ se pueden utilizar para establecer modelos de necrosis de la cabeza femoral. Entre ellos, las ratas, los ratones y los conejos son las especies más utilizadas. La rata, c...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
15ml centrifuge tube	Corning,USA	430791
5mm stainless steel bead	Gelisen,China	5mm
Acetic acid	Merck KGaA, Germany	64-19-7
Anhydrous alcohol	Merck KGaA, Germany	64-17-5
clay	Mincai stationery,China	102
Coverslip	Servicebio,China	WMWD-1818
Flat pressure bottle 10ml	BEHNCKE,China	MD10ml
Formic acid	Macklin Biochemical ,China	64-18-6
HE staining kit	Solarbio,China	G1120
HistoCore AUTOCUT	Leica, Germany	149AUTO00C1
Kinesio tape (elastic therapeutic tape)	Fuluo medicine,China	CL1819
Lipopolysaccharide	Solarbio,China	L8880
Lipopolysaccharides (LPS)	Selleck,USA	S7850
Manual carbon dioxide euthanasia box	Yuyan,China	LC-500-S1
Methylprednisolone sodium succinate,MPS	AbMole,China	M25573
MicroCT	Hiscan,China	Hiscan VM Pro
Neutral resin	Beijing Zhongshan Golden Bridge Biotechnology l ,China	ZLI-9555
Paraffin	Servicebio,China	WGHB-319213129
Paraformaldehyde	Servicebio,China	G1101-500ML
Potassium chloride	Macklin Biochemical ,China	7447-40-7
Slide	Servicebio,China	WG6012
Treadmill for Rats and  mice	Litc Life Science,USA	801
Xylene	Macklin Biochemical ,China	1330-20-7