Transferencia mitocondrial a través de nanotubos de tunelización entre células madre mesenquimales y epitelio pigmentario de la retina in vitro

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo que incluye el rastreo mitocondrial, los procedimientos de cocultivo directo de células madre mesenquimales (MSC) y células epiteliales pigmentarias de la retina (ARPE19), así como los métodos para observar y analizar estadísticamente la formación de nanotubos de túnel (TNT) y la transferencia mitocondrial para caracterizar el intercambio mitocondrial a través de TNT entre MSC y células ARPE19.

Resumen

La transferencia mitocondrial es un fenómeno fisiológico normal que ocurre ampliamente entre varios tipos de células. En el estudio hasta la fecha, la vía más importante para el transporte mitocondrial es a través de nanotubos de efecto túnel (TNT). Ha habido muchos estudios que informan que las células madre mesenquimales (MSC) pueden transferir mitocondrias a otras células mediante TNT. Sin embargo, pocos estudios han demostrado el fenómeno de la transferencia mitocondrial bidireccional. Aquí, nuestro protocolo describe un enfoque experimental para estudiar el fenómeno de la transferencia mitocondrial entre MSCs y células epiteliales pigmentarias de la retina in vitro mediante dos métodos de rastreo mitocondrial.

Co-cultivamos MSCs transfectadas con mito-GFP con células ARPE19 transfectadas con mito-RFP (una línea celular epitelial de pigmento de la retina) durante 24 h. A continuación, todas las células se tiñeron con faloidina y se obtuvieron imágenes mediante microscopía confocal. Observamos mitocondrias con fluorescencia verde en células ARPE19 y mitocondrias con fluorescencia roja en MSCs, lo que indica que la transferencia mitocondrial bidireccional ocurre entre MSCs y células ARPE19. Este fenómeno sugiere que el transporte mitocondrial es un fenómeno fisiológico normal que también ocurre entre las MSC y las células ARPE19, y la transferencia mitocondrial de las MSC a las células ARPE19 ocurre con mucha más frecuencia que viceversa. Nuestros resultados indican que las MSC pueden transferir mitocondrias al epitelio pigmentario de la retina y, de manera similar, predicen que las MSC pueden alcanzar su potencial terapéutico a través del transporte mitocondrial en el epitelio pigmentario de la retina en el futuro. Además, la transferencia mitocondrial de las células ARPE19 a las MSC aún no se ha explorado más a fondo.

Introducción

Las mitocondrias sirven como la principal fuente de energía para la mayoría de los tipos de células, y la disfunción mitocondrial afecta particularmente a los tejidos que demandan alta energía, como la^retina. Las alteraciones metabólicas en la retina pueden desencadenar una crisis bioenergética, que finalmente resulta en la muerte de los fotorreceptores y/o de las células EPR². Las terapias basadas en células madre mesenquimales (MSC) han demostrado eficacia en el tratamiento de la degeneración ocular, y uno de los mecanismos precisos que subyacen a los efectos beneficiosos de las MSC en....

Protocolo

1. Generación de líneas celulares MSC-mito-GFP y ARPE19-mito-RFP

1. Cultivo celular
   NOTA: Aquí solo se utilizan MSC como ejemplo.
   1. Cultivo de MSCs humanas en una placa de 6 pocillos en medio hMSC con 1% de penicilina y estreptomicina (ver Tabla de Materiales) hasta que la densidad celular alcance el 80%-90%. Dependiendo de la densidad de crecimiento celular, cambie el medio una vez cada 2-3 días.
      1. Retire el medio original y lave las células una vez con solución salina tamponada con fosfato (DPBS) (consulte la tabla de materiales). Añadir 1 mL de la mezcla de trip....

Discusión

Numerosos estudios han demostrado que el fenómeno de la transferencia mitocondrial mediada por TNT es un proceso fisiológico prevalente en varios tipos de células tisulares 10,11,12,13. La donación mitocondrial funcional de MSCs a células con disfunción mitocondrial exhibe un fuerte potencial terapéutico

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco	25200-056
4% paraformaldehyde	Solarbio	P1110
6-well plate	NEST	703001
15 mL centrifuge tube	BD Falcon	352097
24-well plate	NEST	702001
ARPE19 cells	ATCC	CRL-2302	Cell lines
Bovine serum albumin (BSA)	Beyotime	ST025
CellTrace violet	Invitrogen	C34557
Cover slide	NEST	801007
DMSO	sigma	D2650
DPBS	Gibco	C141905005BT
DMEM/F-12-GlutaMAX	Gibco	10565-042
Fetal Bovine Serum (FBS)	VivaCell	C04002-500
FluorSave Reagent	Millipore	345789
MSCs	Nuwacell	RC02003	Cell lines
ncMission	Shownin	RP02010
Pen Strep	Gibco	15140-122
pCT-Mito-GFP	SBI	CYTO102-PA-1	Plasmid; From  https://www.systembio.com/mitochondria-cyto-tracer-pct-mito-gfp-cmv
Puromycin	MCE	HY-B1743A
Pipette	Axygen	TF-1000-R-S
Phalloidin	Invitrogen	A22287
Triton X-100	Solarbio	T8200
Transwell plate	Corning	3470