Transferencia mitocondrial a través de nanotubos de tunelización entre células madre mesenquimales y epitelio pigmentario de la retina in vitro

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo que incluye el rastreo mitocondrial, los procedimientos de cocultivo directo de células madre mesenquimales (MSC) y células epiteliales pigmentarias de la retina (ARPE19), así como los métodos para observar y analizar estadísticamente la formación de nanotubos de túnel (TNT) y la transferencia mitocondrial para caracterizar el intercambio mitocondrial a través de TNT entre MSC y células ARPE19.

Resumen

La transferencia mitocondrial es un fenómeno fisiológico normal que ocurre ampliamente entre varios tipos de células. En el estudio hasta la fecha, la vía más importante para el transporte mitocondrial es a través de nanotubos de efecto túnel (TNT). Ha habido muchos estudios que informan que las células madre mesenquimales (MSC) pueden transferir mitocondrias a otras células mediante TNT. Sin embargo, pocos estudios han demostrado el fenómeno de la transferencia mitocondrial bidireccional. Aquí, nuestro protocolo describe un enfoque experimental para estudiar el fenómeno de la transferencia mitocondrial entre MSCs y células epiteliales pigmentarias de la retina in vitro mediante dos métodos de rastreo mitocondrial.

Co-cultivamos MSCs transfectadas con mito-GFP con células ARPE19 transfectadas con mito-RFP (una línea celular epitelial de pigmento de la retina) durante 24 h. A continuación, todas las células se tiñeron con faloidina y se obtuvieron imágenes mediante microscopía confocal. Observamos mitocondrias con fluorescencia verde en células ARPE19 y mitocondrias con fluorescencia roja en MSCs, lo que indica que la transferencia mitocondrial bidireccional ocurre entre MSCs y células ARPE19. Este fenómeno sugiere que el transporte mitocondrial es un fenómeno fisiológico normal que también ocurre entre las MSC y las células ARPE19, y la transferencia mitocondrial de las MSC a las células ARPE19 ocurre con mucha más frecuencia que viceversa. Nuestros resultados indican que las MSC pueden transferir mitocondrias al epitelio pigmentario de la retina y, de manera similar, predicen que las MSC pueden alcanzar su potencial terapéutico a través del transporte mitocondrial en el epitelio pigmentario de la retina en el futuro. Además, la transferencia mitocondrial de las células ARPE19 a las MSC aún no se ha explorado más a fondo.

Introducción

Las mitocondrias sirven como la principal fuente de energía para la mayoría de los tipos de células, y la disfunción mitocondrial afecta particularmente a los tejidos que demandan alta energía, como la^retina. Las alteraciones metabólicas en la retina pueden desencadenar una crisis bioenergética, que finalmente resulta en la muerte de los fotorreceptores y/o de las células EPR². Las terapias basadas en células madre mesenquimales (MSC) han demostrado eficacia en el tratamiento de la degeneración ocular, y uno de los mecanismos precisos que subyacen a los efectos beneficiosos de las MSC en los tejidos de la retina puede atribuirse a la transferencia mitocondrial funcional 3,4,5,6. En 2004, Rustom et al. informaron por primera vez del fenómeno de la transferencia mitocondrial a través de una nueva interacción de célula a célula facilitada por nanotubos de efecto túnel (TNT)⁷.

En el cultivo 2D, los nanotubos de efecto túnel (TNT) se identifican por sus protuberancias de membrana delgadas (20-700 nm) que van desde decenas hasta cientos de nanómetros de longitud, que están suspendidas sobre el sustrato y pueden establecer conexiones directas entre dos o más células homotípicas y heterotípicas. Estas estructuras están notablemente enriquecidas en F-actina y facilitan el transporte de cargas, como las mitocondrias, entre las células. Además, los TNT poseen aberturas en ambos extremos, lo que permite la continuidad del contenido citoplasmático entre las células interconectadas⁸.

Es difícil detectar la transferencia mitocondrial mediada por TNT in vivo debido a la densa disposición celular y a los desafíos en el seguimiento de las mitocondrias. La experimentación in vitro, utilizando técnicas de cocultivo celular y rastreo mitocondrial, permite observar la formación de TNT y la transferencia mitocondrial ^8,9. También observamos el fenómeno de la transferencia mitocondrial mediada por TNT mediante el cocultivo de MSCs y células epiteliales pigmentarias de la retina in vitro¹⁰.

Muchos estudios previos solo han observado la transferencia mitocondrial unidireccional de las MSC a otras células 3,4,5,6. Anteriormente, también intentamos analizar la transferencia mitocondrial bidireccional utilizando dos tipos de células marcadas con mito-tracker verde y mito-tracker rojo, respectivamente, pero la diafonía de los tintes interfirió con los resultados experimentales. Para estudiar con mayor precisión la transferencia bidireccional mitocondrial, aquí construimos dos líneas celulares con diferente fluorescencia mitocondrial utilizando la técnica de transfección lentiviral y, posteriormente, observamos y analizamos los fenómenos de formación de TNT y transferencia bidireccional mitocondrial por cocultivo directo in vitro.

En resumen, aquí se describe un protocolo paso a paso y accionable sobre cómo rastrear mitocondrias, cocultivar MSC con células ARPE19 y analizar la formación de TNT y la transferencia mitocondrial. Los resultados de este experimento demostraron la transferencia mitocondrial bidireccional mediada por TNT, que no solo demostró que el transporte mitocondrial es un fenómeno fisiológico común, sino que también mostró la capacidad terapéutica potencial de las MSC en las células de la retina.

Protocolo

1. Generación de líneas celulares MSC-mito-GFP y ARPE19-mito-RFP

1. Cultivo celular
   NOTA: Aquí solo se utilizan MSC como ejemplo.
   1. Cultivo de MSCs humanas en una placa de 6 pocillos en medio hMSC con 1% de penicilina y estreptomicina (ver Tabla de Materiales) hasta que la densidad celular alcance el 80%-90%. Dependiendo de la densidad de crecimiento celular, cambie el medio una vez cada 2-3 días.
      1. Retire el medio original y lave las células una vez con solución salina tamponada con fosfato (DPBS) (consulte la tabla de materiales). Añadir 1 mL de la mezcla de tripsina-EDTA-DPBS (0,05% de Tripsina-EDTA: 0,25% de Tripsina-EDTA diluido con DPBS en una proporción de 1:5; ver Tabla de Materiales), e incubar durante 3-4 min (dependiendo de las células) en una incubadora a 37 °C.
         NOTA: Observe la digestión celular bajo un microscopio y detenga la digestión si la mayoría de las células están redondeadas y separadas.
      2. Golpee suavemente la placa de 6 pocillos para separar las células adheridas a la superficie y luego agregue 1 ml de medio completo fresco para finalizar la digestión.
      3. Vuelva a suspender suavemente todas las células con una pistola de pipetas y, a continuación, transfiera todas las células recogidas a un tubo de centrífuga de 15 ml.
      4. Centrifugar las células a 200 × g durante 5 min.
      5. Aspirar el sobrenadante y resuspender las células añadiendo 1 mL de medio fresco. Tome 10 μL de suspensión celular para el recuento de células.
      6. Dieciocho a 24 h antes de la transfección lentiviral, siembre células MSC a una densidad de 1 × 10⁵ células por pocillo en placas de 6 pocillos, asegurando que la densidad celular en el momento de la transfección sea de aproximadamente el 50%.
2. Transfección de lentivirus
   NOTA: Todas las operaciones relacionadas con la transfección lentiviral deben realizarse en una cabina de bioseguridad.
   1. Sustituya el medio inicial por 2 mL de medio fresco al día siguiente y añada 25 μL de suspensión de lentivirus (5,00E+08 TU/mL) con adyuvantes, seguido de la incubación a 37 °C.
      NOTA: El empaquetamiento de lentivirus se realizó utilizando el plásmido Mito-GFP (pCT-Mito-copGFP) (ver Tabla de Materiales y Figura Suplementaria S1) por una empresa.
   2. Después de 6 h de incubación, reemplace el medio que contiene el virus con 2 ml de medio fresco. Continúe incubando y cambie el medio una vez al día.
      NOTA: Se observa una expresión significativa de fluorescencia mitocondrial en las MSC 48 h después de la transfección, con un aumento adicional evidente en el punto de tiempo de 72 h.
   3. Cribado de células transfectadas con éxito suplementando el medio de cultivo con puromicina (1 μg/mL) 2 días después de la transfección. Al mismo tiempo, agregue una concentración equivalente de puromicina a las células madre mesenquimales que carecen de transfección viral como control.
      NOTA: El vector viral mito-GFP está diseñado para incluir el gen de resistencia a la puromicina.
   4. Cambie el medio diariamente con la introducción de puromicina (1 μg/mL). Suspender la adición de puromicina tras la muerte celular casi completa en el grupo de control.
      NOTA: El medio no contiene esta concentración de puromicina. La adición de puromicina solo se requiere cuando el medio se agrega a una placa de 6 pocillos.
   5. Continúe con el cultivo sin puromicina hasta que las células hayan pasado y se congelen. Nombra este tipo de célula como MSC-mito-GFP.
      NOTA: Las células ARPE19 se derivaron del banco de células ATCC y se cultivaron en DMEM/F12 que contenían un 10% de FBS y un 1% de penicilina y estreptomicina (ver Tabla de materiales), y los métodos de su digestión y paso son los mismos que los de las MSC. El plásmido Mito-RFP fue modificado a partir de Mito-GFP por una empresa. Finalmente, nombramos a las células transfectadas con éxito como ARPE19-mito-RFP.

2. Cocultivo directo de células MSC y ARPE19

NOTA: En este sistema de cocultivo, las células MSC-mito-GFP servirán como células donantes, mientras que las células ARPE19-mito-RFP funcionarán como células receptoras. Para distinguir entre células donantes y receptoras, rastreamos las células receptoras.

1. Marque las células ARPE19-mito-RFP con CellTrace Violet (consulte la tabla de materiales) en la membrana citoplasmática.
   NOTA: La excitación y la emisión del colorante violeta CellTrace son de 405 nm y 450 nm, respectivamente.
   1. Prepare una solución madre de CellTrace Violet (consulte la tabla de materiales) añadiendo 20 μL de dimetilsulfóxido (DMSO) a un vial de reactivo CellTrace Violet y mezcle bien inmediatamente antes de usar.
   2. Cultive las células ARPE19-mito-RFP hasta la densidad deseada del 80%-90%.
   3. Diluir la solución madre violeta de CellTrace en DPBS precalentado (37 °C) hasta la concentración de trabajo deseada (1:1.000). Esta es la solución de carga.
      NOTA: La dilución de CellTrace Violet debe realizarse con DPBS y no se puede reemplazar con medio de cultivo, ya que esto dará lugar a resultados de tinción muy pobres.
   4. Retire el medio de cultivo y reemplácelo con 1 mL de solución de carga. Incubar las células durante 10 min a 37 °C.
      NOTA: Si las condiciones lo permiten, la tinción se puede observar bajo un microscopio de fluorescencia después de 5 min. La tinción se puede terminar tan pronto como se logren los resultados deseados, ya que es posible que algunas células no puedan tolerar la exposición prolongada a DPBS.
   5. Retire la solución de carga, lave las celdas 2 veces con DPBS y reemplácelas con 2 ml de medio completo nuevo. Incubar las células durante al menos 10 minutos después de la tinción para permitir que el CellTrace Violet se someta a hidrólisis de acetato.
      NOTA: Este paso es necesario para que las células vuelvan a su estado óptimo y para evitar interferir con experimentos posteriores.
2. Prepare una placa de 24 pocillos agregando 50 μL de DPBS en cada pocillo. A continuación, inserte el cubreobjetos (con un diámetro especificado de 15 mm) (consulte la Tabla de materiales) en la placa y deje que se asiente durante 1 minuto. Retire el DPBS de los pocillos, utilizando presión negativa para asegurarse de que la corredera de la tapa esté cerca del fondo del plato.
3. Tripsinizar las MSC donantes y las células ARPE19 receptoras como se describe en el paso 1.1.1.
4. Recuento de células
   1. Coloque 10 μL de suspensión celular en una placa de conteo para la enumeración.
      NOTA: Si la densidad de las células es demasiado alta, se pueden diluir 10 veces con medio y luego proceder como se indicó anteriormente.
   2. Siembre 10.000 MSCs y 10.000 células ARPE19 en 500 μL de medio por pocillo de una placa de 24 pocillos. Mezcle bien las celdas antes de agregarlas a la placa de 24 pocillos. Vea los cálculos que se muestran a continuación dado un recuento de MSC de A/mL y un recuento de células ARPE19 de B/mL.
      NOTA: Para 4 pocillos, se requieren 40,000 MSC y 40,000 celdas ARPE19 en 2 mL de medio.
      Volumen de suspensión de MSC (C) que contiene 40.000 MSC = 40.000/A μL
      Volumen de la suspensión ARPE19 (D) que contiene 40.000 MSCs = 40.000/B μL
      Aumente el volumen a 2 mL con 2 - (C + D) mL de medio.
5. Observe las células bajo un microscopio, agite la placa hasta que las células se distribuyan uniformemente y luego incube en el cultivo durante 24 h.

3. Cocultivo indirecto de células MSC y ARPE19 en un sistema transpocillo

1. Realice el cultivo celular, el etiquetado, la digestión y el recuento como se describe en los pasos 2.1 a 2.4.1.
2. Siembre 20,000 células ARPE19 en 1 mL de medio por pocillo de una placa de 24 pocillos.
   NOTA: En este experimento, utilizamos células ARPE19 sin mitocondrias marcadas.
3. Coloque el inserto en el pocillo donde se ha sembrado la celda.
4. Siembre 10.000 MSCs en 100 μL de medio en la cámara celular superior por pocillo.
5. Repita el paso 2.5.

4. Tinción del citoesqueleto

NOTA: Proteger de la luz durante todo el experimento.

1. Retire el medio de las placas de 24 pocillos. Lave todas las celdas una vez con 500 μL/pocillo de poliformaldehído (PFA) al 4%, agregue 500 μL de PFA fresco al 4% y fije las muestras durante 20 minutos.
   NOTA: Se descartan las inserciones del sistema de pocillos.
   NOTA: Debido a que los nanotubos son muy frágiles, lavamos las células directamente con un 4% de PFA en lugar de DPBS para maximizar la retención de nanotubos intactos.
2. Retire el fijador y lave las muestras durante 3 x 10 min con DPBS.
3. Añadir 500 μL/pocillo de solución de bloqueo compuesta por un 0,5% de Triton X-100 (ver Tabla de Materiales) y un 4% de albúmina sérica bovina (BSA) (ver Tabla de Materiales) e incubar durante 1 h a temperatura ambiente.
4. Retire la solución de bloqueo y lave las muestras durante 3 x 10 min con DPBS.
5. Preparación de la solución de tinción con faloidina (ver Tabla de Materiales)
   NOTA: La excitación y la emisión de faloidina son de 650 nm y 668 nm, respectivamente.
   1. Prepare las soluciones madre disolviendo el contenido del vial en 150 μL de DMSO anhidro para producir una solución madre 400x.
   2. Prepare la solución de tinción diluyendo la solución de almacenamiento 400x a 1x con DPBS. Esta es la solución de tinción con faloidina.
6. Añadir 200 μL de solución de tinción de faloidina a cada pocillo e incubar durante 1 h a temperatura ambiente.
7. Recupere la solución de tinción y lave la muestra 3 x 10 min con DPBS.
   NOTA: Al lavar las celdas con DPBS, será mejor dejar la placa en una coctelera.
8. Toma el cubreobjetos con una aguja de jeringa y deja que se seque al aire.
   NOTA: El estado óptimo es aquel en el que no se puede ver ningún líquido visible en el cubreobjetos pero tampoco está seco.
9. Aplique una pequeña cantidad de medio de montaje (consulte la Tabla de materiales) sobre el portaobjetos y voltee con cuidado el cubreobjetos sobre el portaobjetos para asegurarse de que el medio cubra uniformemente toda la superficie. Sella los bordes con esmalte de uñas.
   NOTA: Espere unos minutos para permitir que el esmalte de uñas se seque.
10. Capture una imagen confocal rápidamente o transfiérala a una caja de rebanadas y guárdela a 4 °C durante un breve período de tiempo.
    NOTA: El tiempo ideal de almacenamiento es de 2 semanas. Si se supera este tiempo, el efecto de la imagen puede deteriorarse.

5. Imágenes confocales

NOTA: Las imágenes confocales se realizan de acuerdo con el manual de operación y pueden variar entre microscopios. Aquí damos solo algunos de los pasos clave.

1. Encienda el microscopio confocal y abra cuatro canales láser (405, 488, 561, 640) de acuerdo con el manual de operación.
2. Acceda al software en la computadora y realice parametrizaciones preliminares del software.
   1. Agregue los canales fluorescentes CF-405, CF-488, CF-561 y CF-640 dentro del panel de Gestión de Procesos .
   2. Ajuste el tiempo de exposición de cada canal de fluorescencia a 200 ms y establezca la intensidad de ganancia en 2 en el panel de control de la cámara.
   3. Ajuste el combinador láser/LED a un valor de 80.
3. Manipule el panel de control externo del microscopio para ajustar la lente del objetivo a un aumento de 20x y asegúrese de que la lente esté colocada en su configuración más baja.
4. Coloque la corredera en orientación invertida en la mesa del soporte.
5. Active el láser de 405 nm y manipule el enfoque utilizando las espirales de enfoque grueso y fino. Observe la muestra debajo del ocular hasta que se vean células fluorescentes azules.
6. Seleccione Live Imaging en la interfaz del software de la computadora, cambie al canal CF-405 y reajuste la hélice de enfoque fino hasta que se vea una imagen distinta de las células que exhiben fluorescencia azul en la pantalla de la computadora.
7. Ajuste la lente del objetivo a un aumento de 40x y haga la transición al canal CF-640, luego ajuste cuidadosamente el enfoque hasta que se vea una estructura de microfilamento celular distinta.
8. Manteniendo una distancia focal constante, realice la transición a los canales CF-405, CF-488 y CF-561 secuencialmente y modifique los parámetros de tiempo de exposición óptimo , intensidad de ganancia y combinador láser/LED para imágenes dentro de cada canal, según sea necesario.
9. Active la función Z Image Stack y defina los puntos inicial y final del eje Z manipulando la distancia focal para capturar una imagen con profundidad utilizando el eje Z.
10. Haga clic en el botón Iniciar en el panel de Gestión de procesos para tomar una foto.
11. Seleccione 10 campos de vista al azar para cada segmento.
    NOTA: No debe haber superposición entre dos campos de visión.
12. Active la función time-lapse, especificando una duración total de la imagen de 24 h y un intervalo fotográfico de 5 min tras la identificación del campo de visión deseado.
    NOTA: Para capturar una secuencia de lapso de tiempo, es necesario inocular las células en un plato con fondo de vidrio y colocarlas dentro de una caja ventilada que contenga un 5% de gas CO₂ .
13. Guarde y exporte todas las imágenes.
    NOTA: Para mejorar el escrutinio de la TNT y la transferencia mitocondrial, se emplearon imágenes de superresolución. Las imágenes de superresolución se realizaron utilizando HIS-SIM comercializada, denominada HIS-SIM (High Intelligent and Sensitive SIM) proporcionada por una empresa. Las imágenes se adquirieron utilizando un objetivo de inmersión en aceite de 100x/1.5 NA.

6. Análisis de datos

1. Para el análisis estadístico de cada imagen, cuantifique el número total de células, el número de nanotubos, el número de células ARPE19-mito-RFE positivas para el violeta, el número de células positivas para el violeta que exhiben fluorescencia verde (que representa el número de células ARPE19 con transferencia mitocondrial de las MSC) y el número de células con fluorescencia roja negativa (que representa el número de células MSC con transferencia mitocondrial de las células ARPE19).
   1. Para cuantificar la formación de TNT, calcule la relación entre el número de nanotubos intercelulares y el número total de células.
   2. Calcule la tasa de transferencia mitocondrial como la relación entre el número de células Violeta positivas que exhiben fluorescencia verde y el número total de células Violeta positivas (que representan la transferencia mitocondrial de las MSC a las células ARPE19) o la relación entre el número de células Violeta negativas que exhiben fluorescencia roja y el número total de células Violeta negativas (que representan la transferencia mitocondrial de las células ARPE19 a las MSC).

Resultados

En la Figura 1 se muestra el diagrama esquemático que ilustra el cocultivo directo de células madre mesenquimales (MSC) y células ARPE19. Las MSC, diseñadas para expresar mito-GFP, como células donantes, y las células ARPE19-mito-RFP con membranas citoplasmáticas marcadas con violeta como células receptoras, se cocultivaron en una proporción de 1:1. Después de un período de cocultivo de 24 horas, las células se tiñeron para detectar faloidina y ...

Discusión

Numerosos estudios han demostrado que el fenómeno de la transferencia mitocondrial mediada por TNT es un proceso fisiológico prevalente en varios tipos de células tisulares 10,11,12,13. La donación mitocondrial funcional de MSCs a células con disfunción mitocondrial exhibe un fuerte potencial terapéutico

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco	25200-056
4% paraformaldehyde	Solarbio	P1110
6-well plate	NEST	703001
15 mL centrifuge tube	BD Falcon	352097
24-well plate	NEST	702001
ARPE19 cells	ATCC	CRL-2302	Cell lines
Bovine serum albumin (BSA)	Beyotime	ST025
CellTrace violet	Invitrogen	C34557
Cover slide	NEST	801007
DMSO	sigma	D2650
DPBS	Gibco	C141905005BT
DMEM/F-12-GlutaMAX	Gibco	10565-042
Fetal Bovine Serum (FBS)	VivaCell	C04002-500
FluorSave Reagent	Millipore	345789
MSCs	Nuwacell	RC02003	Cell lines
ncMission	Shownin	RP02010
Pen Strep	Gibco	15140-122
pCT-Mito-GFP	SBI	CYTO102-PA-1	Plasmid; From  https://www.systembio.com/mitochondria-cyto-tracer-pct-mito-gfp-cmv
Puromycin	MCE	HY-B1743A
Pipette	Axygen	TF-1000-R-S
Phalloidin	Invitrogen	A22287
Triton X-100	Solarbio	T8200
Transwell plate	Corning	3470