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Resumen

Este trabajo presenta un método de extracción rápida de ARN y comparación a nivel de transcripción para analizar la expresión génica en el tardígrado Hypsibius exemplaris. Mediante el uso de la lisis física, este método de alto rendimiento requiere un solo tardígrado como material de partida y da como resultado una producción robusta de ADNc para la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa cuantitativa (qRT-PCR).

Resumen

El tardígrado Hypsibius exemplaris es un organismo modelo emergente reconocido por su capacidad para sobrevivir a condiciones ambientales extremas. Para explorar los mecanismos moleculares y las bases genéticas de dicha extrematolerancia, muchos estudios se basan en la secuenciación de ARN (RNA-seq), que se puede realizar en poblaciones que van desde grandes cohortes hasta animales individuales. La reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR) y la interferencia de ARN (ARNi) se utilizan posteriormente para confirmar los hallazgos de RNA-seq y evaluar los requisitos genéticos de los genes candidatos, respectivamente. Dichos estudios requieren un método eficiente, preciso y asequible para la extracción de ARN y la medición de los niveles relativos de transcripción mediante RT-PCR cuantitativa (qRT-PCR). Este trabajo presenta un método eficiente de extracción de ARN de un solo tardígrado y un solo tubo (STST) que no solo aísla de manera confiable el ARN de los tardígrados individuales, sino que también reduce el tiempo y el costo requeridos para cada extracción. Este método de extracción de ARN produce cantidades de ADNc que se pueden utilizar para amplificar y detectar múltiples transcripciones mediante PCR cuantitativa (qRT-PCR). El método se valida mediante el análisis de los cambios dinámicos en la expresión de los genes que codifican dos proteínas reguladas por el choque térmico, la proteína de choque térmico 70 β2 (HSP70 β2) y la proteína de choque térmico 90α (HSP90α), lo que permite evaluar sus niveles relativos de expresión en individuos expuestos al calor mediante qRT-PCR. STST complementa eficazmente los métodos existentes de extracción de ARN de tardígrado a granel y de un solo tardígrado, lo que permite un examen rápido y asequible de los niveles transcripcionales individuales de tardígrados mediante qRT-PCR.

Introducción

Los tardígrados son pequeños animales pluricelulares reconocidos por su capacidad para sobrevivir a condiciones extremas que son letales para la mayoría de las otras formasde vida. Por ejemplo, estos animales pueden sobrevivir casi 1000 veces la dosis de radiación ionizante que es letal para los humanos 2,3,4,5,6,7,8,9,10, la desecación casi completa 11,12,13,14,15, la congelación en ausencia de adición crioprotectores 16,17,18, y, en su estado disecado, incluso el vacío del espacio 19,20. Debido a su capacidad única de supervivencia en ambientes extremos, estos animales se han convertido en modelos fundamentales para comprender la extrematolerancia en organismos complejos y pluricelulares 1,21,22,23.

La manipulación genética estable de estos notables animales, incluyendo la transgénesis y la modificación de genes de la línea germinal, ha sido difícil de alcanzar hasta hace poco24,25. Como tal, la mayoría de los experimentos para revelar los mecanismos moleculares de la extrematolerancia se realizan a través de perfiles transcripcionales a través de la secuenciación de ARN. Existen muchos conjuntos de datos de secuenciación de ARN valiosos e informativos para tardígrados en diversas condiciones extremas, que van desde la radiación 8,9,26,27,28, el estrés por calor 29, el estrés por congelación12 y la desecación 27,30,31,32,33. Algunos de estos estudios han utilizado métodos de extracción y purificación de ARN a granel para iluminar nuestra comprensión molecular de la extrematolerancia. Sin embargo, la extracción masiva de transcripciones de ARN de muchos animales impide el análisis de la variación en la expresión génica entre individuos, por lo que se pierde la riqueza potencial de conjuntos de datos más refinados. Es importante destacar que estos estudios a menudo analizan poblaciones heterogéneas de animales que incluyen tanto animales que sobreviven a los factores de estrés ambiental como aquellos que no lo hacen. Como tal, estos estudios se confunden al promediar los datos de expresión de múltiples estados de respuesta potencialmente drásticamente diferentes. Para abordar este problema, Arakawa et al., 201634 desarrollaron una elegante tubería de secuenciación de ARN de baja entrada que aplica un kit de extracción de ARN seguido de un paso de amplificación de PCR lineal utilizando un soloanimal 34,35,36 o varios 30,37,38 como entrada. Estos estudios han sido fundamentales para nuestra comprensión de la extrematolerancia a los tardígrados22. Curiosamente, este protocolo también se ha aplicado a la qRT-PCR utilizando siete animales como material de partida24.

En la mayoría de los organismos modelo, una vez identificados los objetivos potenciales a través de RNA-seq, se realiza qRT-PCR para confirmar los cambios transcripcionales identificados por RNA-seq y evaluar el curso del tiempo de expresión de los genes candidatos de una manera de alta resolución. Para probar la función de los genes identificados, estos estudios suelen ir seguidos de la eliminación mediada por ARNi de las dianas moleculares39,40 y el análisis de la capacidad de tolerancia extrema12,41. La eficacia de cada knockdown de ARNi se confirma normalmente mediante qRT-PCR mediante el seguimiento directo de la disminución de la abundancia de transcripciones. Sin embargo, el ARNi es un proceso laborioso en los tardígrados, ya que cada dsRNA debe administrarse mediante microinyección manual de individuos39,40. Debido a la naturaleza de bajo rendimiento de esta estrategia, un método de extracción de ARN rápido y de bajo costo adaptado para qRT-PCR de animales individuales sería muy valioso para la investigación de tardígrados. Aunque se han desarrollado métodos previos para extraer ARN de tardígrados individuales, estos protocolos no han combinado su extracción con qRT-PCR, sino que se han basado en métodos basados en la densidad óptica 12,40,41. Motivados por estos desafíos, buscamos desarrollar un protocolo que produjera de manera confiable ARN en cantidad y calidad que se pueda usar para qRT-PCR a partir de H. exemplaris.

Adaptado de un protocolo de extracción de ARN de un solo animal desarrollado para Caenorhabditis elegans42, STST está optimizado para H. exemplaris. El método de extracción consta de seis pasos rápidos de congelación-descongelación, que alteran físicamente la cutícula, lo que permite la extracción de ARN y la posterior síntesis de ADNc. El método STST disminuye el tiempo de extracción en más de 24 veces en comparación con los métodos de extracción de ARN a granel, como lo describe Boothby, 201843, y en un 30% en comparación con los kits de extracción de ARN de un solo tardígrado, como lo describe Arakawa et al., 201634. Además, el número de interacciones muestra-experimentador se reduce de 5 a solo 1 en comparación con las preparaciones del kit de extracción de ARN, lo que reduce el riesgo de contaminación por ribonucleasas exógenas. Al consultar genes altamente expresados, el método STST produce suficiente ADNc para 25 reacciones cuantitativas de RT-PCR por tardígrado, requiriendo solo 1 μL del volumen total de ADNc de 25 μL por reacción. Sin embargo, las concentraciones de molde deben determinarse empíricamente para transcripciones de menor abundancia.

La eficacia del método STST para analizar los cambios dinámicos en la expresión génica se evaluó mediante la investigación de la expresión diferencial de los genes que codifican la proteína de choque térmico-90α (HSP90α) y la proteína de choque térmico 70β2 (HSP70β2) en respuesta a un choque térmico a corto plazo a 35 °C durante 20 minutos. Tanto HSP70β2 como HSP90α en la mayoría de los organismos eucariotas se regulan rápidamente al alza después de una exposición a corto plazo al choque térmico (20 min)42. El análisis en H. exemplaris reveló que tanto los ARN codificantes de HSP70β2 como los de HSP90α extraídos de tardígrados individuales tratados térmicamente mostraron aumentos estadísticamente significativos en la expresión después de la exposición al calor a corto plazo. Estos hallazgos demuestran que el protocolo STST se puede utilizar para analizar los cambios dinámicos en la expresión génica en animales individuales a lo largo del tiempo.

El método de extracción STST debe complementar los métodos experimentales existentes, como RNA-seq, facilitando la extracción rápida y económica de ARN y la posterior comparación de los niveles de transcripción mediante qRT-PCR. Este método también será valioso para evaluar la eficiencia y la penetrancia del ARNi en individuos inyectados manualmente de manera más cuantitativa que la densidad óptica por sí sola. Finalmente, debido a sus estructuras cuticulares y características físicas similares, es probable que este método también sea efectivo para analizar la expresión génica en otras especies de tardígrados44.

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Protocolo

figure-protocol-102
Figura 1: Tubería de un solo tubo para la extracción de ARN de un solo tardígrado. (A) Esquema que muestra el protocolo para la extracción de ARN de un solo tardígrado, incluidos seis ciclos de congelación-descongelación y la posterior síntesis de ADNc. Posteriormente, las muestras se pueden utilizar para RT-PCR y qRT-PCR. (B) Imagen del cono de la micropipeta utilizada para la eliminación del agua. Barra de escala: 2 mm. (C) Imagen de campo claro de un tardígrado en un pequeño volumen de agua (línea punteada). La eliminación de la mayor parte del agua en la medida mostrada es necesaria para una extracción exitosa y evita la dilución del tampón de lisis. Barra de escala: 50 μm. (D) Imagen que muestra la inmersión de muestras en nitrógeno líquido utilizando pinzas largas para congelar y descongelar rápidamente las muestras de manera segura. Parte del contenido fue creado en BioRender. Kirk, M. (2022) BioRender.com/d93s511 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

NOTA: La Figura 1A muestra un esquema del procedimiento. Para conocer los procedimientos detallados de cultivo de tardígrados y algas, consultar los informes publicados anteriormente 45,46,47.

1. Esterilización del agua de manantial

  1. Vierta 2 L de agua de manantial de una jarra de agua de 5 galones (consulte la Tabla de Materiales para conocer los detalles) en una botella de vidrio apta para autoclave de 2 L.
  2. Coloque la tapa en la botella apta para autoclave y selle con una pequeña cantidad de cinta adhesiva para autoclave. No apriete la botella; Coloque la tapa en la parte superior.
  3. Esterilizar el agua de manantial en autoclave durante 50 minutos en un ciclo húmedo sin paso de secado.
  4. Deje que el agua alcance la temperatura ambiente (RT) y selle la tapa firmemente antes de almacenarla en RT.

2. Extracción de micropipetas de vidrio (con un extractor de pipetas)

  1. Fije una micropipeta de vidrio (diámetro exterior: 1 mm, diámetro interior: 0,58 mm, longitud: 10 cm) en un extractor de micropipetas. Evite el contacto con el filamento calefactor, ya que esto alterará la forma de la pipeta y dañará el filamento.
    1. Determine empíricamente la tracción de la pipeta para cada filamento y extractor de pipeta. Sin embargo, para que sirva como punto de partida para la optimización, utilice 78 °C y un solo paso de tracción de peso de tracción de 182,2 g.
  2. Deje que el filamento se caliente y la gravedad separe la micropipeta de vidrio en dos micropipetas de vidrio con puntas afiladas (Figura 1B).
  3. Guarde estas micropipetas de vidrio estirado en una placa de Petri cerrada de 100 mm con cera o arcilla para mantenerlas en su lugar y evitar que se rompan las puntas afiladas.

3. Extracción de micropipetas de vidrio (sin extractor de pipetas)

  1. Encienda un mechero Bunsen u otra fuente de llama controlada a baja temperatura.
  2. Tome una micropipeta de vidrio con un extremo en cada mano.
  3. Sostenga el centro de la micropipeta de vidrio sobre la llama hasta que el vidrio comience a derretirse. Luego, separe rápidamente los dos extremos. Esto creará dos puntas afiladas muy delicadas.
  4. Rompa ligeramente la punta con un par de pinzas finas estériles.
  5. Guarde estas micropipetas de vidrio estirado en una placa de Petri cerrada de 100 mm con cera o arcilla para mantenerlas en su lugar y evitar que se rompan las puntas afiladas.

4. Extracción de ARN

  1. Obtenga 0,5 L de nitrógeno líquido en un recipiente crioseguro.
    PRECAUCIÓN: El nitrógeno líquido es criogénico y puede causar quemaduras si se expone a la piel o los ojos. Al manipular, use ropa protectora, gafas protectoras, guantes de nitrilo, guantes criogénicos, una bata de laboratorio y zapatos cerrados. Asegúrese de que el recipiente sea seguro para el nitrógeno líquido antes de transportar el líquido. También puede ser posible usar un baño de hielo seco con etanol para este paso.
  2. Prepare la mezcla maestra de síntesis de ADNc: una solución de 10 μL que contiene 1 μL de cebador de hexámero aleatorio, 2 μL de DNasa, 4 μL de tampón RT 5x, 1 μL de mezcla de enzimas, 1 μL de H2O y 1 μL de dNTP de 10 mM. Guarde esta solución en hielo.
  3. Prepare el tampón de lisis para tardígrados (5 mM Tris (pH = 8), 0,5% (v/v) Detergente 1, 0,5% (v/v) Detergente 2, 0,25 mM EDTA en agua estéril sin nucleasas).
    NOTA: Esta solución se puede almacenar en la mesa de trabajo durante 6 meses. Sin embargo, mantenga la esterilidad y evite las posibles fuentes contaminantes de ARNasa.
  4. Tampón de lisis alícuota suficiente para las extracciones (2 μL/tardígrado).
  5. Añadir inhibidor de ARNasa a la solución tampón de lisis tardígrada hasta una concentración final de 4 U/μL.
  6. Agite y centrifuga la solución en RT en una centrífuga de sobremesa a una velocidad de 2000 x g durante 5 s antes de almacenar la solución en hielo.
  7. Retire del cultivo tantos tardígrados como sean necesarios para el experimento con una pipeta P1000 estéril con punta de filtro y colóquelos en una placa de Petri estéril de 35 mm.
    NOTA: Cualquier número de tardígrados puede ser procesado de esta manera. Por lo general, se procesan tres tardígrados por condición para la extracción.
  8. Lave los tardígrados tres veces, utilizando 1 ml de agua de manantial estéril esterilizada en autoclave y una pipeta P1000 estéril con punta de filtro. Pipetearlos lentamente hacia arriba y hacia abajo ayuda a eliminar los contaminantes de las algas.
  9. Utilizando un microscopio de disección con un aumento de 25x a 50x, transfiera un solo tardígrado de este cultivo lavado a una nueva placa de Petri estéril de 35 mm utilizando una pipeta P10 estéril con punta de filtro.
  10. Utilice una pipeta P200 estéril con punta de filtro para lavar el tardígrado único en 100 μL de agua estéril sin nucleasas.
    NOTA: Este paso de lavado se utiliza para eliminar aún más los contaminantes, incluidas las ribonucleasas.
  11. Transfiera el tardígrado lavado al fondo de un tubo de PCR limpio y estéril en 1-2 μL de agua estéril sin nucleasas utilizando una pipeta P10 estéril con punta de filtro, asegurándose cuidadosamente de que el tardígrado no se pegue al costado de la punta.
  12. Visualice el tardígrado bajo un microscopio de disección con un aumento de 25x.
  13. Para facilitar la eliminación del agua, rompa ligeramente la punta de la micropipeta de vidrio estirado fuera del tubo. Asegúrese de que el orificio sea lo suficientemente grande como para sacar el agua, pero no el tardígrado.
  14. Utilizando la acción capilar de una micropipeta de vidrio estirado, extraiga el agua hasta que el animal esté rodeado por una pequeña burbuja de agua de aproximadamente dos longitudes tardígradas de diámetro.
  15. Supervise el proceso de eliminación de agua a través del endoscopio de disección para asegurarse de que el nivel del agua sea adecuado y que el tardígrado permanezca hidratado.
    NOTA: La Figura 1C ofrece un ejemplo de la cantidad de agua que se debe eliminar. Este es un paso crítico. Una pequeña burbuja de agua rodeará al tardígrado para evitar que se seque, pero se debe eliminar la mayor cantidad posible de agua excesiva para evitar la dilución del tampón de lisis. Para ver un ejemplo de los niveles de agua restantes, consulte la Figura 1C.
  16. Inmediatamente después de extraer el agua, añadir 2 μL de tampón de lisis tardígrado en el fondo del tubo, brevemente en vórtice, y centrifugar el tubo a RT durante 5 s a 2000 x g en una centrífuga de mesa.
  17. Coloque inmediatamente las muestras que contienen los tardígrados en una gradilla de tubos de PCR y asegúrese de que estén sujetas firmemente por la rejilla.
  18. Sujete la rejilla con un par de pinzas largas y gruesas y sumerja suavemente la rejilla que contiene las muestras en el nitrógeno líquido hasta que esté completamente congelada (Figura 1D).
  19. Retire la rejilla del nitrógeno líquido y colóquela inmediatamente sobre hielo. Deje que la muestra se descongele (tarda ~ 45 s a 1 min). Controle la muestra cada 15 s retirándola del hielo e inspeccionándola visiblemente. Una vez que la muestra esté visiblemente transparente, continúe con el siguiente paso.
  20. Repita los pasos 4.18-4.19 cinco veces más. Se requieren un total de seis ciclos de congelación-descongelación para obtener la máxima lisis y extracción (Figura 2A, B).
  21. Una vez que se complete la congelación-descongelación, coloque las muestras en hielo e inmediatamente continúe con el siguiente paso. No congele las muestras en este punto para almacenarlas, ya que esto disminuirá el ARN disponible para la preparación del ADNc.

5. Síntesis de ADNc

  1. Añada 2 μL de mezcla maestra de síntesis de ADNc al tubo de PCR que contiene lisado de tardígrado. Agite brevemente el tubo y gírelo a RT a 2000 x g durante 5 s con una centrífuga de mesa antes de reemplazar las muestras en hielo.
  2. Coloque las muestras en un termociclador e incube a 25 °C durante 10 min para recocer cebadores, a 55 °C durante 30 min para realizar la transcripción inversa y, finalmente, enzimas inactivas por calor a 85 °C durante 5 min.
  3. Después de la incubación, coloque inmediatamente el tubo en hielo y diluya la muestra hasta un volumen total de 25 μL añadiendo 21 μL de agua estéril sin nucleasa. En el caso de transcripciones con un número bajo de copias, modifique este paso de dilución según lo determine empíricamente.

6. qPCR

  1. Determine la temperatura de recocido del conjunto de cebadores utilizando ARN total preparado a partir de grandes cantidades de tardígrados, por ejemplo, el método de extracción a granel presentado en Boothby, 201843.
  2. Ejecute un gradiente de temperatura de PCR para determinar la temperatura óptima de recocido antes de ejecutar qRT-PCR (para todas las configuraciones de PCR utilizadas en este protocolo, consulte la Tabla 1 y la Tabla 2).
  3. Descongele un tubo de tinte indicador supermix en hielo y aísle de la luz. Coloque una placa de qPCR de 96 pocillos en hielo y coloque 5 μL de supermezcla, 2 μL de agua, 1 μL de cada cebador (10 μM) y 1 μL de producto de ADNc en el número de pocillos deseados.
  4. Selle la placa de PCR con un sello de placa y ejecute la qRT-PCR utilizando una temperatura de recocido adecuada para el conjunto de cebadores (para todas las configuraciones de qRT-PCR utilizadas en este documento, consulte la Tabla 3).

7. Cuantificación e interpretación de resultados

  1. Comparar los resultados cuantitativamente con uno o más genes de control, cuya expresión se espera que sea constante a lo largo de las condiciones impuestas. Para este estudio se utilizó el gen de la actina.
  2. Obtenga y compare los valores Ct o el umbral del ciclo para cada pocillo con los valores Ct de las reacciones génicas de mantenimiento de control. Calcule el cambio de pliegue en la expresión génica utilizando la siguiente ecuación:
    figure-protocol-12310
    figure-protocol-12404
    figure-protocol-12498
    NOTA: La expresión génica de pliegue se representa gráficamente para cada transcripción y tardígrado como un 2-(ΔΔCt)48.
  3. Para obtener una estimación aproximada del número de transcripción a partir del valorC t, utilice la siguiente ecuación:
    figure-protocol-12928
    Donde N es el número de transcritos y 2 es la eficiencia de PCR asumida o el aumento de pliegues en la fluorescencia por ciclo de PCR48.

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Resultados

Desarrollo y optimización de la extracción de ARN de un solo tardígrado
Adaptando el protocolo de Ly et al., 201542 para la extracción de ARN en tardígrados, se optimiza el sistema STST para maximizar la cantidad y calidad de la preparación (Figura 1A). Se realizó RT-PCR para los transcritos de actina, cuantificando el rendimiento de la transcripción mediante la amplificación de una región de 527 pb que a...

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Discusión

Este estudio presenta un método eficiente para la extracción de ARN para qRT-PCR de un solo tardígrado. La comparación directa de la metodología STST con un kit de extracción de ARN de un solo tardígrado existente reveló que la extracción de ARN STST produce cantidades >200 veces mayores de transcripciones de ARN de actina, reduce el costo a menos de un dólar por muestra y reduce el tiempo requerido para la extracción en un 30%. Para aplicar la STST a una pregunta biológica r...

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Divulgaciones

Los autores declaran no tener conflictos de intereses que divulgar.

Agradecimientos

Queremos agradecer a la Beca Ruth Kirschstein de los NIH # 5F32AG081056-02 y a la Beca Postdoctoral Errett Fisher, que apoyó a la Dra. Molly J. Kirk, a la Beca de la Familia Crowe, que apoyó a Chaoming Xu, y a una Beca del Senado Académico de la Universidad de California, Santa Bárbara, y a las subvenciones de los NIH #R01GM143771 y #2R01HD081266, que apoyaron estos esfuerzos de investigación. Los autores también reconocen el uso del Laboratorio de Nanoestructuras Biológicas dentro del Instituto de Nanosistemas de California, apoyado por la Universidad de California, Santa Bárbara, y la Universidad de California, Oficina del Presidente.

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
10 µL Premium Barrier Tips Low Binding, Racked, SterileGenesee Scientific23-401Refered to as Sterile Filter-Tipped P 10 Pipette  Tips
1000 µL  Premium Pipet Tips, Low Binding, Racked, SterileGenesee Scientific23-165RSRefered to as Sterile Filter-Tipped P 1000 Pipette  Tips
200 µL  Premium Barrier Tips Low Binding, Racked, SterileGenesee Scientific23-412Refered to as Sterile Filter-Tipped P 200 Pipette  Tips
4 Star Straight Strong Medium Point Tweezer Excelta 00-SA-DCRefered to as Long forceps
96-Well PCR Rack with Lid Assorted, 5 Racks/UnitGenesee Scientific27-202ARefered to as PCR Rack
Andwin Scientific 3M LEAD FREE AUTOCLAVE TAPE 1"Thermo Fisher Scientific NC0802040Refered to as Autoclave Tape 
Autoclave TapeThermo Fisher ScientificAB1170Refered to as PCR Plate Seals
Benchling v8BenchlingN/ARefered to as Benchling 
BioRadHard-Shell 96-Well PCR PlateBioRad HSS9641Refered to as PCR Plate 
BULWARK FR Lab Coat: Grainger 26CF64Refered to as Lab Coat
C1000 Touch Bio-rad Thermocycler BioRad1851148Refered to as Thermocycler 
C1000 Touch Bio-rad Thermocycler with CFX Optics Module BioRad1845097Refered to as qPCR thermocycler 
Chloroccoccum hypnosporum.  Carolina152091Refered to as Algae
Corning PYREX Reusable Media Storage BottlesThermo Fisher Scientific06-414-1ERefered to as 2 L Autoclave-safe Glass Bottle
Daigger & Company Vortex-Genie 2 Laboratory Mixer Thermo Fisher Scientific 3030ARefered to as Vortexer 
Direct-zol Micro Prep Zymo Research R2060Refered to as RNA extraction kit 
Dumont 5 Biology TweezersFine Science Tools 11254-20Refered to as Fine Forceps
EDTA Fisher ScientificS311-500 Refered to as EDTA 
FIJI v 2.14.0/1.54f ImageJ,N/ARefered to as FIJI/ImageJ
Filament for pippette Puller Tritech ResearchPC-10HRefered to as Filament
Fisherbrand Economy Impact GogglesFisher Scientific19-181-501Refered to as Splash Goggles 
Glass Micropipette O.D. 1mm ID 0.58, Length 10 cmTriTech ResearchGD-1 Reffered to as glass micropipette
Hypsibius exemplaris Z151 Strain Carolina133960Refered to as Tardigrades  or H. exemplaris 
Liquid Nitrogen Dewar 1 LAgar Scientific AGB7475Refered to as Cryo-safe container 
Maxima H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit Thermo Fisher ScientificK1651Refered to as cDNA Synthesis Master Mix 
Narishige Dual-Stage Glass Micropipette Puller Tritech Research PC-10Refered to as micropipette puller 
Nitrile GlovesFisher Scientific17-000-314Refered to as Nitrile Gloves 
PETRI DISH, PS, 35/10 mm, WITH VENTSGrenier627102Refered to as 35 mm Petri dish 
PIPETMAN P10, 1–10 µL, Metal EjectorGilsonF144055MRefered to as P 10 Pipette
PIPETMAN P1000, 100–1000 µL, Metal EjectorGilsonF144059MRefered to as P 1000 Pipette
PIPETMAN P200, 20–200 µL, Metal EjectorGilson F144058MRefered to as P 200 Pipette
Pound This 4-Color Modeling Clay American Science Surplus 96517P001Refered to as Clay 
Prism v10.0 GraphPadN/ARefered to a Prism 
RNAse-Free, 8 Strip 0.2 mL PCR Tubes with caps InvitrogenAM12230Refered to as Sterile PCR Tube
RNasin Ribonuclease InhibitorPromega N2111Refered to as RNAse inhibitor 
Spring water Nestle Pure Life44221229Refered to as Spring Water
SsoAdvanced Universal SYBR Green SupermixBIO RAD1725271Refered to as Indicator Dye Super mix 
Stereo-Microscope System w/optics and illumination TriTech ResearchSMT1Refered to as Dissecting Microscope
Supertek Scientific Tirrill BurnersThermo Fisher ScientificS09572BRefered to as Bunsen Burner 
Table Top CentrifugeQualitron DW-41-115-NEWRefered to as Table Top Centrifuge 
Tempshield Cryo-GlovesFisher Scientific11-394-305Refered to as Cryo Gloves 
Thermo Scientific Nunc Petri DishesThermo Fisher Scientific08-757-099Refered to as 100 mm Petri dish 
Tris baseFisher ScientificT395-500 Refered to as Tris or Tris Base 
Triton X-100Fluka 93443Refered to as Detergent 1 
TWEEN 20Sigma aldrichP1379-500 Refered to as Detergent 2
Water - PCR/RT-PCR certified, nuclease-freeGrowcellsPCPW-0500Refered to as Sterile Nuclease Free Water

Referencias

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