Identificación de células T raras específicas de antígeno de pulmones de ratón con tetrámeros del complejo de histocompatibilidad peptídico:principal

Resumen

Proporcionamos un protocolo detallado para aislar e identificar poblaciones de células T específicas de antígenos raros en pulmones de ratón a través del enriquecimiento de células T basado en perlas magnéticas y tetrámeros del complejo de histocompatibilidad mayor (MHC) de péptidos.

Resumen

La identificación y caracterización de las células T específicas de antígeno durante la salud y la enfermedad sigue siendo clave para mejorar nuestra comprensión de la fisiopatología inmunitaria. Los desafíos técnicos del seguimiento de las poblaciones de linfocitos T específicos de antígeno dentro del repertorio de linfocitos T endógenos han avanzado enormemente gracias al desarrollo de reactivos tetrámeros péptido:MHC. Estos multímeros solubles marcados con fluorescencia de moléculas MHC de clase I o clase II complejadas con epítopos peptídicos antigénicos se unen directamente a las células T con la correspondiente especificidad del receptor de células T (TCR) y, por lo tanto, pueden identificar poblaciones de células T específicas de antígeno en su estado nativo sin necesidad de una respuesta funcional inducida ex vivo estimulación. Para poblaciones extremadamente raras, las células T unidas a tetrámeros se pueden enriquecer magnéticamente para aumentar la sensibilidad y la fiabilidad de la detección.

A medida que se profundiza la investigación de la inmunidad de las células T residentes en los tejidos, existe una necesidad apremiante de identificar las células T específicas de antígeno que trafican y residen en los tejidos no linfoides. En este protocolo, presentamos un conjunto detallado de instrucciones para el aislamiento y la caracterización de las células T específicas de antígeno presentes en los pulmones de ratón. Esto implica el aislamiento de las células T del tejido pulmonar digerido, seguido de un paso general de enriquecimiento magnético de células T y tinción con tetrámeros para el análisis y la clasificación de la citometría de flujo. Los pasos destacados en este protocolo utilizan técnicas comunes y reactivos fácilmente disponibles, lo que lo hace accesible para casi cualquier investigador dedicado a la inmunología de células T de ratón, y son altamente adaptables para una variedad de análisis posteriores de cualquier población de células T específicas de antígeno de baja frecuencia que resida dentro de los pulmones.

Introducción

En el corazón del sistema inmunitario adaptativo se encuentra la capacidad de una célula T para reconocer y responder a un antígeno específico. El momento y el lugar en que una célula T responde a su antígeno afín determina el equilibrio de la infección y la autoinmunidad, la homeostasis y el cáncer, la salud y^{la enfermedad.} De ello se deduce que el estudio de las células T en un contexto específico de inmunidad debe centrarse en las células con especificidad para un antígeno relevante de interés. Entre los avances tecnológicos que han mejorado en gran medida la capacidad de caracterizar las poblaciones de linfocitos T específicos de antígeno s....

Protocolo

Los procedimientos descritos en este protocolo están aprobados y desarrollados de acuerdo con las pautas establecidas por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) del Hospital General de Massachusetts, un programa de manejo animal acreditado por la Asociación Americana para la Acreditación del Cuidado de Animales de Laboratorio (AAALAC). Los experimentos se realizaron en ratones machos y hembras de 8 a 12 semanas de edad con un fondo genético C57BL/6 criados y mantenidos en las instalaciones de animales de MGH en condiciones específicas libres de patógenos.

1. Preparación de soluciones madre

1. Pr....

Discusión

Las caracterizaciones previas de las células T específicas de antígeno de los pulmones se han beneficiado de la gran cantidad de células T específicas de antígeno que se expanden después de un evento de cebado agudo, como la inmunización intranasal o la infección 20,21,22. Sin embargo, las poblaciones de linfocitos T más raras en los pulmones, como los linfocitos T específicos de antígeno propio o los linfocitos T de.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm cell strainer	Fisher Scientific	22-363-549
10x PBS without Ca++ or Mg++	Corning	46-013-CM
1x PBS without Ca++ or Mg++	Corning	21-031-CV
AccuCheck Counting Beads	Invitrogen	PCB100
Aminoguanidine Hemisulfate Salt	Sigma-Aldrich	A7009
CD90.2 microbeads, mouse	Miltenyi	130-121-278
Cell separation magnet (MidiMACS Separator)	Miltenyi	130-042-302	Holds single LS column
Cell separation magnet (QuadroMACS Separator)	Miltenyi	130-090-976	Holds 4 LS columns
Dasatinib	Sigma-Aldrich	CDS023389
DNase I	Roche	10104159001
Eagle’s Ham’s Amino Acids medium	Sigma-Aldrich	C5572
gentleMACS	Miltenyi	130-093-235	Automated tissue dissociator
gentleMACS C Tubes	Miltenyi	130-093-237	Automated tissue dissociator tubes
Hank's Balanced Salt Solution with Ca++ or Mg++	Corning	21-020-CM
HEPES	Gibco	15630080
Ketamine	Vedco	NDC 50989-996-06
Liberase TM	Roche	5401119001
Pacific Blue anti-mouse CD45 antibody (Clone: 30-F11)	Biolegend	103126
Paramagnetic cell separation columns (LS Columns)	Miltenyi	130-042-401	Comes with plunger
Purified anti mouse CD16/32 antibody (Clone: 93)	Biolegend	101302
RPMI 1640 medium without L-glutamine	Corning	15-040-CM
Sodium Chloride 0.9% (Normal Saline)	Cytiva	Z1376
Xylazine	Pivetal	NDC 466066-750-02