Técnica de administración intranasal de agregados de α-sinucleína

Resumen

El presente protocolo describe un método para la administración intranasal de agregados de α-sinucleína. Este método proporciona información sobre la propagación de la α-sinucleína desde la mucosa olfativa hasta el bulbo olfatorio en la enfermedad de Parkinson.

Resumen

La enfermedad de Parkinson (EP) es un trastorno neurodegenerativo caracterizado por la presencia de cuerpos de Lewy, que son agregados de α-sinucleína (α-Syn). Recientemente, se propuso que la enfermedad se desarrollara y progresara a través de la propagación en forma de prión de agregados de α-Syn desde el bulbo olfatorio (OB) o el núcleo dorsal del nervio vago. Aunque el origen de los agregados de α-Syn en el OB sigue sin estar claro, recientemente se ha sugerido su propagación desde la mucosa olfativa. Previamente demostramos que la administración intranasal de agregados de α-Syn en un modelo de ratón indujo una patología α-Syn en el OB de ratones. En este estudio, presentamos un método de administración intranasal de agregados de α-Syn que indujo la patología α-Syn en el OB de ratones. La administración intranasal de agregados de α-Syn es un método muy sencillo y directo, y creemos que será una herramienta útil en la investigación para dilucidar el origen de la patología de α-Syn en el OB y la vía de propagación del α-Syn a través del sistema olfativo.

Introducción

La enfermedad de Parkinson (EP), que se caracteriza por síntomas motores como bradicinesia, temblores en reposo y rigidez muscular, es el segundo trastorno neurodegenerativo más común¹. La EP también presenta síntomas no motores, como disfunción olfativa, deterioro cognitivo, depresión, alucinaciones, estreñimiento e hipotensión ortostática. Sus características patológicas son la muerte celular dopaminérgica en la sustancia negra y la presencia de agregados de α-sinucleína (α-Syn), llamados cuerpos de Lewy².

Cabe destacar que α-Syn es una proteína de 140 aminoácidos que existe en forma de monómero soluble (o tetrámero) en condiciones normales. Sin embargo, en condiciones anormales, el monómero soluble se convierte en agregados insolubles de alto peso molecular, incluidos oligómeros y fibrillas. La transición de α-Syn a oligómeros y fibrillas está implicada en la toxicidad celular³.

Estudios recientes han sugerido la propagación de agregados de α-Syn entre neuronas. Basándose en numerosas autopsias, Braak et al. propusieron en 2003 la hipótesis de que la patología con cuerpos de Lewy se disemina progresivamente en el cerebro de forma un tanto estereotipada (hipótesis de Braak)^4,5. En 2008, el examen postmortem de pacientes con EP que recibieron trasplantes fetales de mesencéfalo reveló cuerpos de Lewy en neuronas dopaminérgicas derivadas de tejidos fetales ^6,7. Estos estudios sugirieron que los agregados de α-Syn podrían propagarse desde el cerebro enfermo a los injertos, lo que apoya la hipótesis de Braak.

A raíz de estas observaciones, experimentos con cultivos neuronales primarios e inyección intracerebral de agregados de α-Syn en ratones han reproducido la propagación de agregados similares al cuerpo de Lewy, proporcionando más evidencia para la propagación de α-Syn de manera similar a un prión ^8,9.

Braak et al. demostraron que la patología con cuerpos de Lewy en la EP se inicia en el bulbo olfatorio (OB) y/o en el núcleo dorsal del nervio vago (dmX)⁴. Con base en la hipótesis de Braak, varios estudios han reportado la administración de agregados de α-Syn o extractos de cuerpos de Lewy de cerebros con EP en el tracto OB y gastrointestinal de animales de experimentación 10,11,12. En 2018, un estudio demostró que la administración de agregados de α-Syn en el OB de ratones de tipo salvaje indujo la propagación de la patología α-Syn a lo largo de la vía olfativa, lo que resultó en una disfunción olfativa¹³. Previamente inoculamos agregados de α-Syn en el OB de ratones transgénicos α-Syn y descubrimos que esto conducía a la atrofia del hipocampo y al deterioro de la memoria¹⁴.

En 2022, inoculamos agregados de α-Syn en el OB de titíes, un pequeño primate no humano; esto resultó en la propagación de la patología α-Syn a lo largo de la vía olfativa, atrofia OB y un hipometabolismo cerebral generalizado de la glucosa¹⁰.

Sin embargo, si la propagación de los agregados α-Syn se produce desde el OB, surge una pregunta crítica: ¿por qué mecanismo aparecen inicialmente los agregados α-Syn? Saito et al. informaron previamente la presencia de cuerpos de Lewy en la mucosa nasal¹⁵. La presencia de agregados de α-Syn se detectó en la mucosa nasal de pacientes con EP y atrofia multisistémica (AMS) mediante análisis de conversión inducida por terremotos en tiempo real (RT-QUIC)¹⁶. En particular, el análisis de muestras de mucosa nasal de pacientes con trastorno del comportamiento del sueño por movimientos oculares rápidos (RBD), que se considera una etapa prodrómica de la EP, reveló un aumento en los niveles de α-Syn¹⁷. Este estudio sugirió que la patología α-Syn podría existir en la mucosa nasal incluso desde la fase prodrómica de la EP.

Si bien estos hallazgos sugirieron una posible ruta desde la mucosa nasal hasta el OB, ha habido evidencia experimental limitada que respalda este escenario. Para abordar esta brecha, administramos agregados de α-Syn en la cavidad nasal de ratones e investigamos la propagación de la patología de α-Syn desde la mucosa nasal hasta el OB. Nuestro enfoque experimental demostró que la administración intranasal de una sola dosis de agregados de α-Syn en ratones de tipo salvaje indujo la patología de α-Syn en el OB, proporcionando evidencia experimental de la vía de propagación desde la mucosa nasal hasta el OB.

Protocolo

Para este estudio se utilizaron ratones machos C57BL/6J de 2 meses de edad. Todos los procedimientos experimentales se realizaron de acuerdo con las directrices nacionales. El Comité de Investigación Animal de la Universidad de Kioto otorgó la aprobación ética y el permiso para este estudio (MedKyo 23,544).

1. Administración intranasal de fibrillas preformadas de α-Syn

1. Prepare la solución de fibrillas de α-Syn de ratón en PBS (4 mg/mL) de acuerdo con los métodos descritos anteriormente¹¹. Envuelva el tubo con una película transparente para evitar la contaminación.
2. Sonicar 200 μL de solución de fibrillas de α-Syn para generar fibrillas preformadas de α-Syn (PFF) utilizando un sonicador de tipo baño de agua (Tabla de Materiales). Llene el baño ultrasónico con agua y añada cubitos de hielo para que se enfríe a 4 °C para la sonicación. Sonicar fibrillas durante un total de 5 minutos, y cada ciclo consta de 30 s de sonicación seguidos de un intervalo de 30 s (un total de cinco ciclos).
   NOTA: Use equipo de protección personal como guantes desechables, mascarilla y gafas de seguridad para evitar la exposición al α-Syn.
3. Prepare una pipeta P10 (Tabla de materiales) con una punta de pipeta de 10 μL. Anestesiar a cada ratón con una combinación de clorhidrato de medetomidina, midazolam y butorfanol (MMB) mediante inyección intraperitoneal (i.p.). El agente anestésico combinado MMB contenía midazolam (0,3 mg/kg), medetomidina (4 mg/kg) y tartrato de butorfanol (5 mg/kg). Use 0,005 mL/g por inyección i.p. cuando mezcle midazolam (1 mg/mL) 0,3 mL, medetomidina (5 mg/mL) 0,8 mL, tartrato de butorfanol (5 mg/mL) 1 mL y solución salina 2,9 mL.
4. Espere 10 minutos para asegurarse de que los ratones estén completamente anestesiados. La anestesia adecuada se puede confirmar si el ratón está en decúbito lateral y no puede enderezarse. Una vez anestesiado, aplique la pomada oftálmica utilizando un aplicador de algodón estéril para evitar que se sequen los ojos.
   NOTA: Sin anestesia, cuando se administran dosis nasales, es difícil mantener a los ratones en decúbito supino y administrar correctamente la solución de α-Syn mientras los ratones estornudan. Por estas razones, la sedación fue necesaria.
5. Coloque el ratón anestesiado en posición supina. Coloque una toalla de papel o un material similar debajo del cuerpo, asegurándose de una ligera inclinación de la cabeza hacia abajo (Figura 1A, B). Esta posición evita que la solución de α-Syn administrada fluya rápidamente hacia los pulmones o el esófago, lo que facilita su retención en la cavidad nasal. Las fosas nasales se ven en la Figura 1C.
6. Extraiga 1 μL de solución α-Syn (4 mg/mL) en una pipeta P10 y coloque la punta de la pipeta cerca de la nariz del ratón. Forme lentamente una gota redonda y manténgala en el extremo de la punta de la pipeta (Figura 1D, flecha roja). La administración intranasal se realiza por la fosa nasal unilateral, utilizando el lado contralateral como lado de control.
7. Acerque la gota a un lado de las fosas nasales del ratón y permita que el ratón la inhale de forma natural. Observe la inhalación y espere de 30 s a 1 min (Figura 1E).
8. Repita los pasos 1.6.-1.7. hasta que se administre un volumen total de 20 μL de solución de α-Syn. Después de todos los procedimientos, deseche los guantes y limpie un banco con detergentes comerciales si la superficie está contaminada con α-Syn
   NOTA: Todo el procedimiento debe realizarse en un gabinete de seguridad para evitar la inhalación de fibrillas de α-Syn por parte del personal que realiza el procedimiento. Un informe previo ha demostrado que el volumen de 25 μL es el más eficiente para la administración de fármacos de nariz a cerebro¹⁸. Utilizamos un volumen similar de 20 μL en el presente estudio. También utilizamos la misma concentración de PFFs que la inyectada en el OB en el informe anterior¹⁰, que está cerca de los 400 μM (5,6 mg/mL) de PFFs¹⁹.
9. Administrar atipamezol (3 mg/kg; Tabla de Materiales) Por inyección I.P. para revertir la medetomidina y facilitar la recuperación. Use 0,005 mL/g por inyección i.p. cuando mezcle atipamezol (5 mg/mL), 0,6 mL y solución salina 4,4 mL.
   NOTA: Proporcionar analgesia porque no se comprende completamente lo estresante que sería la administración intranasal de α-Syn.
10. No deje al ratón desatendido hasta que haya recuperado la conciencia suficiente para mantener la decúbito esternal. Después de la recuperación completa, regrese el ratón a la jaula.

2. Preparación de la muestra

1. Sacrificar los ratones tratados a los 1, 3, 6 y 12 meses después de la administración intranasal de fibrillas preformadas de α-Syn.
   1. Coloque los ratones en la caja de inducción, administre sevoflurano (>6,5%) y continúe hasta que ocurra un paro respiratorio durante > 60 s. Retirar los ratones y realizar una exanguinación rápida mediante incisión auricular derecha para asegurar la eutanasia.
2. Inserte una aguja de 25G (Tabla de Materiales) en el ápice del corazón. Perfundir el ratón a 4 mL/min con 15 mL de PBS y luego 15 mL de PFA al 4% en PBS.
3. Corta la cabeza con unas tijeras y haz una incisión de 2 cm en el cuero cabelludo con un bisturí. Incidir el hueso craneal con unas tijeras en el lado lateral desde la parte inferior hasta la nariz (Figura 2A,B). Para obtener los OB, extraiga completamente el hueso craneal de los OB (Figura 2B, círculo amarillo).
4. Voltee la cabeza, corte los nervios cerebrales y luego extraiga el cerebro cuidadosamente con fórceps (Figura 2C, D). Obtener el cerebro con OBs intactos (Figura 2E). Para obtener los OB intactos, corte cuidadosamente los nervios olfativos con pinzas a medida que los OB se unen al hueso del cráneo (Figura 2D, círculo amarillo).
5. Coloque las muestras de cerebro en el PFA al 4% en PBS durante la noche a 4 °C. No deje las muestras de cerebro por más de 24 h.
   NOTA: La fijación excesiva disminuirá la tinción inmunohistoquímica. Si se requiere almacenamiento a largo plazo, conserve las muestras de cerebro en etanol al 70% o PBS que contengan azida de sodio al 0,1% para mantener la esterilidad.

3. Tinción inmunohistoquímica del OB

1. Parafinar las muestras utilizando un procesador automático de tejidos (Tabla de Materiales) como se describe a continuación.
   1. Sumerja en etanol al 70% durante 120 min, seguido de una inmersión en etanol al 100% durante 8x durante 60 min. Luego, sumérjalo en xileno al 100% durante 3 veces durante 120 minutos.
   2. Sumergir en parafina a 60 °C durante 120 min, seguido de una inmersión en parafina a 60 °C durante 240 min.
2. Incruste las muestras en parafina como se describe a continuación.
   1. Incrustar las muestras en parafina a 60 °C con un centro de inclusión de tejido modular (Tabla de Materiales). Enfríelos con hielo.
3. Cortar las muestras en secciones de 8 μm de espesor con un micrótomo (Tabla de Materiales)¹⁸.
4. Realice la desparafinación como se describe a continuación.
   1. Sumerja en xileno al 100% durante 2 veces durante 5 minutos, seguido de sumérjalo en etanol al 100% durante 2 veces durante 3 minutos.
   2. Sumergir en etanol al 70% durante 3 min. Lavar en PBS durante 3 min.
5. Lleve a cabo la recuperación de antígenos como se describe a continuación.
   1. Sumergir en ácido fórmico al 100% durante 15 min. Enjuague con solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante 2 min.
   2. Autoclave a 120 °C durante 10 min. Deja que se enfríe de forma natural.
6. Sumerja en peróxido de hidrógeno al 1% en metanol durante 10 min. Lavar en PBS durante 5 min.
7. Añadir 500 μL de leche desnatada al 5% en PBS en los portaobjetos e incubarlos durante 30 min a temperatura ambiente.
8. Coloque los 500 μL de anticuerpo antifosforilado α-Syn (p-α-Syn, 1/10000) en PBS en los portaobjetos e incube durante la noche a 4 °C. Lavar 2 veces con PBS durante 5 minutos cada una.
9. Incubar con polímero de inmunoperoxidasa universal, anti-Conejo (Tabla de Materiales) durante 1 h a 25 °C. Lavar 2 veces con PBS durante 5 minutos cada una.
10. Revele utilizando el kit de tinción de 3,3'-diaminobenzidina (DAB) (Tabla de materiales) durante 5 min de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
11. Sumergir en solución de hematoxilina durante 1 min (Tabla de Materiales). Decolorar en agua corriente durante 10 min.
12. Realice el montaje como se describe a continuación.
    1. Sumergir en etanol al 70% durante 5 min. Sumergir en etanol al 100% 2x durante 5 min.
    2. Sumergir en xileno al 100% 2 veces durante 5 min. Montaje utilizando un medio de incrustación (Tabla de Materiales). Aplique los 100 μL de un medio de inclusión a los portaobjetos y cúbralos con un cubreobjetos de vidrio.
13. Adquiera imágenes utilizando un microscopio todo en uno con aumentos de 20x y 40x (Tabla de materiales).

Resultados

La Figura 3 muestra varios ejemplos de agregados α-Syn en el OB. En el presente estudio, administramos agregados de α-Syn en la fosa nasal unilateral. Las dos cavidades nasales están separadas por el tabique nasal, y cada OB proyecta las neuronas sensoriales olfativas a cada cavidad nasal por separado. Por lo tanto, el OB del lado contralateral se puede utilizar como control.

No se observó patología de P-α-Syn en el OB del l...

Discusión

En un estudio previo, la administración de agregados de α-Syn en la cavidad nasal de macacos indujo la muerte de células dopaminérgicas y el depósito de hierro en la sustancia negra, aunque no se observaron agregados de α-Syn²¹. Se informó que la administración diaria de agregados de α-Syn humano A53T en la cavidad nasal de ratones transgénicos promotores de priones α-Syn (ratones M83) durante 28 días induce patología α-Syn en el cerebro y síntomas ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
All-in-One Fluorescence Microscope BZ-X710	KEYENCE	N/A	All-in-One microscope
Ampicillin Sodium Salt	Nacalai tesque	02739-32
Bioruptor II	Sonicbio	BR2006A	Water bath type sonicator.
Butorphanol tartrate	Meiji Seika Pharma	WAK-52850
Cellulose tube	MISUMI	UC20-32-100
DeepWellMaximizer	TAITEC	MBR-022UP	Shaker
DynaCompetent Cells Zip BL21(DE3)	BioDynamics Laboratory Inc.	DS255	Competent cell
Entellan	Sigma-Aldrich	107961	Rapid mounting medium for microscopy
Graefe Extra Fine Forceps Curved Serrated	FST	11152-10	forceps
Hardened Fine Scissors	FST	14090-09	scissors
Histofine Simple stain mouse MAX-PO (R)	Nichirei Bioscience	414341	Universal Immuno-peroxidase Polymer, anti-Rabbit
ImageJ ver 1.52p	NA	NA	https://imagej.net/
innova4200	New Brunswick scientific	9105085	Incubator shaker
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside	Nacalai tesque	19742-94
LB broth, Lennox	Nacalai tesque	20066-24
Leica EG 1150 H	Leica	14 0388 86 108	Modular Tissue Embedding Center
Leica TP 1020	Leica	14 0422 85108	Automatic Tissue Processor
Medetomidine	Fuji Film	135-17473
Microm HM325 Rotary Microtome	Thermo Scientific	902100
Midazolam	Maruishi Seiyaku	4987-211-76210-0
New hematoxylin Type G	Muto	65-9197-38	Hematoxylin solution
Normal winged needle for vein D type, 25G	TERUMO	NN2332R	25G needle
Optima TLX Ultracentrifuge	Beckman Couler	8043-30-1197	Ultracentrifuge
P10 pipette	Gilson	FA10002P
Paraffin	Leica	39601095
paraformaldehyde	Nacalai tesque	30525-89-4
Peroxidase Stain DAB Kit	Nacalai tesque	25985-50
Pirece BCA Protein Assay Kits	Thermo Scientific	23225	BCA assay
pRK172	Addgene	#134504	Plasmid
Q-Sepharose Fast Flow.	cytiva	17051001	Ion exchange resin