Monitorización de la acumulación de nanofármacos en metástasis de cáncer de mama murino

Resumen

Aquí, describimos el protocolo para la administración in vivo de nanopartículas magnéticas de óxido de hierro portadoras de oligómeros de ARN al cáncer de mama metastásico en modelos animales, proporcionando un enfoque clínicamente viable para el silenciamiento terapéutico de ácidos nucleicos oncogénicos.

Resumen

El cáncer de mama metastásico es una enfermedad devastadora con opciones terapéuticas muy limitadas, que requiere nuevas estrategias terapéuticas. Se ha demostrado que los miARN oncogénicos están asociados con el potencial metastásico del cáncer de mama y están implicados en la migración, invasión y viabilidad de las células tumorales. Sin embargo, puede ser difícil administrar una molécula de ARN inhibidor al tejido de interés. Para superar este desafío y administrar oligonucleótidos antisentido activos a los tumores, utilizamos nanopartículas magnéticas de óxido de hierro como plataforma de administración. Estas nanopartículas se dirigen a tejidos con mayor permeabilidad vascular, como sitios de inflamación o cáncer. La administración de estas nanopartículas se puede monitorear in vivo mediante imágenes de resonancia magnética (RM) debido a sus propiedades magnéticas. La traslación de este enfoque terapéutico a la clínica será más accesible debido a su compatibilidad con esta modalidad de imagen relevante. También se pueden marcar con otros reporteros de imagen, como un tinte óptico de infrarrojo cercano Cy5.5 para imágenes ópticas correlativas y microscopía de fluorescencia. Aquí, demostramos que las nanopartículas marcadas con Cy5.5 y conjugadas con oligómeros terapéuticos dirigidos a miRNA-10b oncogénico (denominado MN-anti-miR10b, o "nanofármaco") administradas por vía intravenosa se acumulan en sitios metastásicos, lo que abre la posibilidad de intervención terapéutica del cáncer de mama metastásico.

Introducción

A pesar de los muchos avances en el tratamiento del cáncer de mama, las opciones clínicas para la enfermedad metastásica siguen siendo limitadas. Los pacientes suelen recibir terapias dirigidas contra los factores identificados en el tumor primario, como el estrógeno o el HER2, pero estos factores no siempre se conservan en las metástasis, lo que hace que el tratamiento sea ineficaz¹. Otras terapias sistémicas, como la quimioterapia, son inespecíficas y conocidas por sus efectos secundarios. Para desarrollar opciones efectivas para el tratamiento del cáncer de mama metastásico, es importante tener en cuenta los impulsores biológicos que permiten que las células cancerosas se propaguen y colonicen sitios distantes. Uno de estos impulsores es el miR-10b, un microARN oncogénico, implicado en la viabilidad, invasión y migración de las células de cáncer de mama, que ha demostrado ser suficiente para conferir potencial metastásico en células de cáncer de mama que de otro modo no serían metastásicas ^2,3. Es importante destacar que miR-10b también se expresa en niveles más altos en las metástasis en comparación con los tumores primarios emparejados⁴, lo que lo convierte en un objetivo prometedor para el tratamiento de las metástasis existentes.

Aunque los miARN como el miR-10b tienen un gran potencial como dianas terapéuticas para la enfermedad metastásica, el diseño de métodos terapéuticamente viables para el silenciamiento de los miARN presenta retos únicos. Los oligonucleótidos antisentido (ASO) que se unen a su secuencia complementaria de miARN se transfieren comúnmente a las células in vitro mediante lipofección, pero no pueden llegar fácilmente a las células tumorales in vivo debido a la inestabilidad inherente, el riesgo de destrucción por nucleasas, la corta vida media de la sangre y la incapacidad de ingresar a las células debido a la repulsión carga-carga⁵. Para combatir estos desafíos, desarrollamos un portador clínicamente aplicable para biomoléculas utilizando nanopartículas magnéticas de óxido de hierro (MNP) recubiertas de ^dextrano6. Los grupos amina en la nanopartícula permiten la conjugación de oligonucleótidos, colorantes fluorescentes (por ejemplo, Cy5.5) y fracciones dirigidas. Además, el núcleo de óxido de hierro permite la monitorización in vivo de la entrega del vehículo mediante imágenes de resonancia magnética (IRM). Conjugamos el ácido nucleico bloqueado anti-miR-10b ASO y Cy5.5 con MNP para crear un "nanofármaco" denominado MN-anti-miR10b, representado en la Figura 1⁷.

En nuestros estudios anteriores, demostramos que el nanofármaco provoca eficazmente la regulación a la baja de miR-10b e inhibe la migración e invasión de células de cáncer de mama triple negativo in vitro⁷. En modelos murinos de cáncer de mama metastásico, la administración intravenosa del nanofármaco evitó el desarrollo de metástasis en los ganglios linfáticos o, si se administró después de la formación de metástasis en los ganglios linfáticos, detuvo su crecimiento⁷. En particular, se observó que el nanofármaco se acumulaba fácilmente en los tejidos cancerosos. Si bien el nanofármaco no erradicó las metástasis por sí solo, en estudios posteriores demostramos que el tratamiento combinado con doxorrubicina adyuvante fue curativo tanto en modelos de ratón inmunocomprometidos como inmunocompetentes ^3,8. Los efectos de la inhibición de miR-10b por el nanofármaco también se han observado en el carcinoma mamario felino⁹.

Para tratar eficazmente el cáncer de mama, es imprescindible demostrar que el fármaco se acumula en los tejidos de interés. Aquí, presentamos un protocolo para demostrar la acumulación del portador de nanopartículas magnéticas utilizado para administrar ASO terapéuticos anti-miR-10b a tejidos cancerosos utilizando múltiples modalidades en modelos murinos de cáncer de mama metastásico.

Protocolo

El Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Estatal de Michigan (IACUC, por sus siglas en inglés) ha aprobado todos los procedimientos que involucran a sujetos animales. Los valores de los cálculos se resumen en la Tabla 1.

1. Pasos clave de la síntesis de MN-anti-miR10b

NOTA: Los detalles de la síntesis de MN-anti-miR10b han sido descritos previamente ^9,10,11.

1. Prepare el núcleo de nanopartículas magnéticas (MN) mediante el método de coprecipitación.
2. Reticulación y aminado de las nanopartículas preparadas utilizando hidróxido de sodio, epiclorhidrina e hidróxido de amonio.
3. Conjugue un éster Cy5.5-NHS a MN a través del reticulante heterobifuncional N-succinimidil 3-[2-piriditio]-propionato (SPDP) para obtener MN-Cy5.5 para permitir la obtención de imágenes de fluorescencia y microscopía.
4. Active el ácido nucleico bloqueado anti-miR-10b con tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) al 3% y conjugue a MN-Cy5.5 para producir el MN-anti-miR10b.
5. Realizar la caracterización del conjugado para determinar el contenido de hierro (por ensayo de hierro), el número de moléculas Cy5.5 por nanopartícula (por espectrofotometría) y la cantidad de LNA conjugado (por electroforesis en gel de agarosa).

2. Adquirir animales de estudio

1. Esbozar el estudio con antelación para planificar los grupos experimentales y el número de animales por grupo. Alberga hasta 5 ratones por jaula. Si se utilizan varias jaulas de 5 ratones durante el tratamiento, asegúrese de tener ratones de control y experimentales dentro de cada jaula para eliminar la jaula como una variable de confusión.
2. Obtener ratones a las 6-7 semanas de edad. Permita al menos 1 semana de aclimatación a las condiciones de alojamiento antes de la inducción de tumores ortotópicos.
   NOTA: A continuación se describen los procedimientos que utilizan el modelo MDA-MB-231 (línea celular derivada del ser humano) de metástasis espontánea del cáncer de mama. Para este modelo, se utilizan comúnmente ratones desnudos atímicos (Foxn1^nu/Foxn1^nu). Se pueden utilizar otras cepas de ratones inmunocomprometidas compatibles, y los procedimientos también son aplicables a modelos de aloinjerto en ratones inmunocompetentes (por ejemplo, células de cáncer de mama 4T1 en ratones BALB/c).

3. Cultivo de células

1. Complemente el Medio Eagle Modificado (DMEM) de Dulbecco con un 10% de suero fetal bovino (FBS) y un 1% de penicilina-estreptomicina (medio de crecimiento completo) para cultivar células MDA-MB-231 que expresan luciferasa (por ejemplo, MDA-MB-231-luc-D3H2LN). Cultivar las células en condiciones asépticas a 37 °C con 5% de CO₂ y 95% de humedad, generalmente en un matraz T75. Si se congelan, descongele las células y el conducto al menos una vez antes de la implantación del tumor. Registre el número de paso en el matraz.
   NOTA: En este estudio, un vial previamente congelado de 1 × 10⁶ células se descongeló y se pasó dos veces antes de su uso.
   1. Para el paso, aplique tripsina al 0,25% durante 3 min a 37 °C para tripsinizar las células con una confluencia del <80%. Agregue 4 veces el volumen de medio de crecimiento completo para neutralizar la tripsina.
   2. Centrifugar la suspensión a 200 × g durante 5 min en un tubo cónico. Vuelva a suspender el pellet celular en 5 mL de medio de crecimiento completo después de decantar el sobrenadante. Alícuota una porción de las células a un nuevo matraz y agregue medio de crecimiento completo adicional en función del volumen del nuevo matraz. Actualice el número de paso en el nuevo matraz.
2. Descongele las células nuevas después de 10 pasadas para minimizar la deriva genética entre los estudios.

4. Preparación de células para la inducción de tumores ortotópicos

1. Colocar Matrigel congelado (extracto de matriz de membrana basal) a 4 °C durante 24 h antes de la preparación para permitir que el extracto de matriz se licúe.
2. Determinar la concentración y el volumen de células necesarias para el estudio. Implante a los ratones 1 × 10⁶ células por ratón en un volumen de 50 μL, compuesto por 1 parte de PBS refrigerado y 1 parte del extracto de la matriz.
3. Granule las células tripsinizadas como se describe en el paso 3.1.2. Vuelva a suspender el pellet de celdas en al menos 10 mL de PBS para lavar las células, luego centrifugue una vez más a 200 × g durante 5 min. Vuelva a suspender el pellet en 500 μL de PBS refrigerado (stock de celdas).
4. Cuente las células con un hemocitómetro. Como las células estarán en una concentración alta, diluya una pequeña alícuota (por ejemplo, 10 μL) según sea necesario, realizando un seguimiento del factor de dilución hasta que se puedan tomar mediciones precisas.
5. Diluya el número total requerido de células a 40 × 10⁶ células/mL, luego agregue un volumen igual del extracto de matriz enfriada para lograr una concentración final de 1 × 10⁶ celdas por 50 μL. Manténgalo en hielo para evitar que el extracto se solidifique antes de la implantación.
   NOTA: Las concentraciones celulares se resumen en la Tabla 1.

5. Inducción de tumores ortotópicos

1. Anestesiar un ratón con isoflurano al 2% y luego transferirlo a un cono nasal, manteniendo el plano quirúrgico de la anestesia con isoflurano al 0-3% en una almohadilla térmica. Confirmar el plano quirúrgico de la anestesia por falta de reflejo corneal y/o respuesta de pinzamiento del dedo del pie. Protéjase contra la sequedad de la córnea aplicando ungüento oftálmico en los ojos.
2. Limpie la piel cerca del lugar de la inyección con una toallita con alcohol al 70% y espere unos segundos para que el alcohol se seque. Inducir en la glándula mamaria #4 para reducir el riesgo de superposición de las señales de imágenes de bioluminiscencia entre el tumor primario y los sitios más comunes de metástasis (pulmón y ganglio linfático axilar).
   NOTA: La numeración de las glándulas mamarias ha sido descrita anteriormente¹². Brevemente, un ratón en posición supina con la cabeza orientada hacia arriba tendrá glándulas 1 a 5 en el lado derecho del inyector (izquierda del ratón) comenzando desde la más cercana a la cabeza (cervical - glándula 1) y descendiendo hasta la más caudal (inguinal - glándula 5). Las glándulas 6 a 10 están orientadas de manera similar en el lado opuesto del animal.
3. Pipetear el stock de células hacia arriba y hacia abajo para resuspender las células. Extraiga 50 μL de la suspensión de células heladas en una jeringa de insulina con una aguja de 29 G e inyecte las células inmediatamente. Mantenga la jeringa en hielo si no puede inyectarla inmediatamente.
   NOTA: Pipetear hacia arriba y hacia abajo entre cada extracción de células para evitar que las células se asienten.
4. Inserte el bisel directamente debajo del pezón de la glándula mamaria deseada paralelo al cuerpo del ratón en ese lugar e inyecte las células a un ritmo constante y lento. Deje la aguja dentro de la piel durante al menos 5 segundos después de completar la inyección para permitir que el Matrigel se solidifique y evite fugas.
5. Mueva el ratón a una jaula limpia en una almohadilla térmica para su recuperación y supervise hasta que esté completamente ambulatorio y pueda mantener la decúbito esternal. No deje el ratón desatendido. Regrese el ratón a su jaula con otros ratones solo después de que se haya recuperado.

6. Monitorización del crecimiento tumoral y el desarrollo de metástasis con imágenes de bioluminiscencia (BLI)

NOTA: Como las células MDA-MB-231 utilizadas aquí expresan luciferasa, la inyección de sustrato de luciferina en ratones producirá una señal óptica detectada por el escáner del sistema de imágenes. En este modelo, se pueden esperar metástasis a las 5-7 semanas después de la inducción tumoral. Se recomienda tomar imágenes de los ratones de 1 a 3 veces por semana, dependiendo de la importancia de identificar el momento exacto en el que se visualizan las metástasis.

1. Anestesiar a los ratones con isoflurano al 2% para minimizar el riesgo de lesiones al ratón al administrar luciferina. Protéjase contra la sequedad de la córnea aplicando ungüento oftálmico en los ojos.
2. Inyecte 150 mg/kg de peso corporal de luciferina por vía intraperitoneal en cada ratón y devuelva a los ratones a su jaula en una almohadilla térmica para permitir que los ratones se despierten y metabolicen la luciferina. Supervise y no deje a los ratones desatendidos hasta que estén completamente ambulatorios y puedan mantener la decúbito esternal.
   NOTA: Los valores utilizados para los cálculos de dosificación se resumen en la Tabla 1.
3. Obtener imágenes de los ratones utilizando el escáner del sistema de imágenes a partir de aproximadamente 10 minutos después de la inyección de luciferina, reanestesiando a los ratones cuando sea necesario para dar tiempo a la transferencia al IVIS.
   1. Imagine hasta 5 ratones juntos en posición supina, teniendo cuidado de asegurarse de que todo su cuerpo esté incluido en las marcas de la guía del campo de visión y orientado lo más recto posible. Use cinta adhesiva transparente para asegurar sus brazos para una mejor visualización de los ganglios linfáticos axilares. Si toma imágenes de varios ratones a la vez, use divisores de colectores para separar a los ratones y evitar que las señales se irradien a otros ratones. Si no hay separadores disponibles, use tiras de papel que absorba la luz en su lugar (por ejemplo, cartulina gruesa y negra).
      NOTA: Las tasas de metabolismo de la luciferina varían según los modelos de ratón y líneas celulares, y es posible que la adquisición de imágenes a partir de los 10 minutos posteriores a la inyección no produzca la señal más fuerte. Se recomienda que, al comienzo de un nuevo estudio, se realicen adquisiciones en diferentes puntos temporales para determinar el momento de la intensidad máxima de la señal.
   2. Prepare el software del sistema de imágenes para la adquisición de imágenes con los siguientes ajustes para BLI: Exposición = Automático, Agrupación = Medio, FStop = 1, Excitación = Bloque, Emisión = Abierto, FOV = D, Altura = 1,50.
   3. Por lo general, las señales del tumor primario producirán una señal relativamente fuerte debido a su ubicación superficial utilizando la configuración Exposición = Automático. Si está monitoreando metástasis, use cinta aislante negra para cubrir cuidadosamente el tumor primario y configure manualmente la exposición = 300 s (o más) para adquirir señales débiles si están presentes.
      NOTA: En este modelo, una señal separada del tumor primario que es visible durante varias sesiones de imágenes cuando el umbral inferior se establece en 5 × 10³ de radiación se considera indicativa de metástasis.

7. Resección de tumores primarios

NOTA: La resección de los tumores primarios es importante para los estudios longitudinales (por ejemplo, terapéuticos) de las metástasis; De lo contrario, los ratones pueden sucumbir a la morbilidad relacionada con el crecimiento sin restricciones del tumor primario. Tenga en cuenta el tamaño del tumor primario (riesgo de pérdida de sangre en la resección) y la ulceración (riesgo de infección) al determinar el momento de la resección.

1. Si se considera la ausencia de señal de BLI para probar el éxito de la resección del tumor primario, se deben realizar imágenes preoperatorias como se describe en la sección 6 y confirmar que no hay señales después de la cirugía. Confirme la resección exitosa dentro de los próximos 1-2 días con luciferina recién administrada.
   NOTA: No se recomienda la readministración inmediata de luciferina para evitar estrés innecesario al animal. La luciferina inyectada antes de la resección del tumor primario debería ser suficiente para detectar la señal si la resección no se completó.
2. Anestesiar al ratón con isoflurano al 2% y luego transferirlo a un cono nasal, manteniendo el plano quirúrgico de la anestesia con isoflurano al 0-3% en una almohadilla térmica. Confirmar el plano quirúrgico de la anestesia por la falta de reflejo corneal y/o respuesta de pinzamiento del dedo del pie.
3. Proteger contra la sequedad de la córnea aplicando ungüento oftálmico en los ojos
4. Inyecte 5 mg/kg de ketoprofeno por vía subcutánea como analgesia para el procedimiento.
   NOTA: Los valores utilizados para los cálculos de dosificación se resumen en la Tabla 1.
5. Prepare el área quirúrgica alternando batas de alcohol al 70% y betadine 3x. Deje que el exfoliante final de betadine se seque antes de continuar.
6. Use tijeras quirúrgicas estériles para abrir la piel por encima del tumor primario verticalmente (rostral-caudal). En el caso de la piel ulcerada, comience a abrirse hacia el lado de la ulceración para evitar dejar el tumor primario y para eliminar completamente la piel ulcerada.
7. Continúe usando tijeras y fórceps para diseccionar cuidadosamente el tejido conectivo alrededor del tumor encapsulado para eliminar completamente la masa de la piel, así como los tejidos corporales subyacentes, ya que cualquier tumor restante puede volver a crecer.
8. Si está presente, controle el sangrado aplicando presión con un aplicador con punta de algodón.
9. Cierre la abertura quirúrgica con sutura Vicryl 5-0.
   NOTA: La sutura interrumpida puede resultar en una mejor permeabilidad de la herida, ya que los ratones son propensos a molestar el sitio quirúrgico.
10. Permita que el animal se recupere en una jaula limpia sobre una almohadilla térmica hasta que esté completamente ambulatorio. Coloque la comida humedecida en el fondo de la jaula de la casa cuando regrese al animal a la jaula.
11. Inyecte 5 mg/kg de ketoprofeno por vía subcutánea una vez al día durante al menos 2 días después de la cirugía. Revise el estado de la herida en estos momentos.

8. Entrega de nanofármaco

1. Pesar a los ratones, ya que la dosis del nanofármaco se basa en el peso corporal.
2. Anestesiar al ratón con isoflurano al 2% y luego transferirlo a un cono nasal, manteniendo el plano quirúrgico de la anestesia con isoflurano al 0-3% en una almohadilla térmica. Confirmar el plano quirúrgico de la anestesia por la falta de reflejo corneal y/o respuesta de pinzamiento del dedo del pie.
   NOTA: Alternativamente, el nanofármaco puede administrarse a un ratón despierto restringido. Todos los pasos posteriores serían los mismos.
3. Prepare una jeringa de insulina con una aguja de 29 g con 10 mg de nanofármaco Fe/kg de peso corporal del ratón.
4. Sumergir la cola del animal en agua tibia (30-35 °C) durante 30 s para dilatar las venas de la cola.
5. Limpie el exceso de agua de la cola y limpie el lugar de la inyección con una toallita con alcohol al 70%.
6. Inserte el bisel de la aguja en la vena lateral de la cola aproximadamente a la mitad de la cola y tire ligeramente hacia atrás del émbolo para confirmar la colocación con un retroceso de sangre en la aguja. Si es necesario, mueva la aguja ligeramente hacia adelante o a una profundidad más superficial para lograr una colocación exitosa.
7. Tras una inserción exitosa, inyecte el nanofármaco de manera constante a una velocidad lenta de aproximadamente 5-10 s para una inyección de 40 μL. Confirme el éxito de la inyección por la falta de acumulación de solución debajo de la piel de la cola cerca del lugar de la inyección y por el oscurecimiento de la vena (de la solución oscura de nanopartículas).
   NOTA: Los valores utilizados para los cálculos de dosificación se resumen en la Tabla 1. Las formulaciones de nanopartículas agrupadas pueden embolizar al pulmón. Si se observa dificultad respiratoria poco después de la inyección, realice compresiones torácicas suavemente en el ratón. La acción inmediata siempre resulta en la recuperación exitosa del animal de este posible problema.
8. Mantenga la presión sobre el sitio de la inyección con una gasa y retire la aguja, manteniendo la presión durante aproximadamente 30 segundos hasta que se detenga el sangrado.
9. Permita que el animal se recupere en una jaula limpia sobre una almohadilla térmica hasta que esté completamente ambulatorio.

9. Recogida de metástasis para su análisis

1. Visualice los ratones mediante BLI como se describe en la sección 6.
   NOTA: En este estudio, la radiación de 5 × 10³ se considera indicativa de metástasis y generalmente se observa a las 5-7 semanas. Es de esperar una ligera variación en el tiempo hasta la metástasis entre los ratones.
2. Inmediatamente después de la toma de imágenes, se sacrificaron los ratones por luxación cervical bajo una cantidad pesada (5%) de isoflurano. Antes de la disección, confirmar la muerte por falta de reflejo corneal y/o respuesta de pinzamiento del dedo del pie.
3. Recoja cuidadosamente las metástasis. Las metástasis de los ganglios linfáticos se presentan como una masa agrandada y encapsulada. Las metástasis pulmonares generalmente se distribuyen por todo el parénquima pulmonar; Por lo tanto, recoge todo el pulmón.
4. Coloque los tejidos recolectados en una placa de Petri y obtenga imágenes utilizando el sistema de imágenes para confirmar la bioluminiscencia (que indica la presencia de células cancerosas que expresan luciferasa) y la fluorescencia (que indica la acumulación de nanofármacos). Utilice la misma configuración de adquisición BLI que se describe en el paso 6.3.2. Los ajustes de adquisición de FLI son Exposición = Automático, Agrupación = Medio, FStop = 1, Excitación = 675 y Emisión = 720 (programa predeterminado para el tinte Cy5.5), Nivel de lámpara = Alto, FOV = D, Altura 1.50. Tome una imagen del cadáver del ratón para determinar si queda tejido canceroso que valga la pena recolectar.
5. Enjuague los tejidos cancerosos con PBS.
6. Para recolectar tejidos para microscopía o qRT-PCR, insértelos en OCT y guárdelos a -80 °C hasta que estén listos para el procesamiento.
7. Para recolectar tejidos para la espectroscopia de emisión óptica de plasma acoplado inductivamente (ICP-OES), tara una báscula utilizando un tubo vacío de 1,7 mL, coloque el tejido en el tubo y registre su peso. Congele el pañuelo y guárdelo a -80 °C hasta que esté listo para procesar.

10. Validación de la administración de nanofármacos por microscopía de fluorescencia

1. Crioseccionar las muestras frescas congeladas incluidas en OCT en portaobjetos de microscopía de 10 μm de espesor. Ajuste las temperaturas de la cámara y del portamuestras según el tipo de tejido. Los ajustes entre -20 °C y -15 °C son apropiados tanto para el tejido pulmonar como para el linfático.
2. Fije las secciones de tejido en portaobjetos sumergiendo las secciones o portaobjetos enteros en una solución de paraformaldehído al 4% durante 15 minutos. Enjuague cuidadosamente con PBS.
3. Monta cubreobjetos en las correderas. Utilice un medio con 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) para la visualización de la arquitectura de los tejidos.
4. Utilice un microscopio de fluorescencia para examinar secciones de Cy5.5 (excitación de 683 nm/emisión de 703 nm), lo que indica la administración de nanofármacos. Confirme que la señal no es de fondo utilizando una muestra de control negativa (tejido de un animal no inyectado).

11. Validación de la administración de nanofármacos mediante espectroscopia de emisión óptica de plasma acoplado inductivamente (ICP-OES)

1. Transfiera las muestras almacenadas a -80 °C a un tubo cónico de 15 mL e incube en un horno sin tapón a 37 °C para que se seque.
   NOTA: Este proceso tardó 24 horas para las muestras de metástasis de MDA-MB-231, pero puede tardar varios días dependiendo del tamaño y el contenido de humedad de la muestra.
2. Registre el peso seco con una balanza.
3. Agregue 2 mL de trazas de_HNO3 al 70% al recipiente y digiera la muestra en el microondas. Los parámetros utilizados en este estudio son los siguientes: Potencia = 1030 - 1800 W, Tiempo de rampa = 20:00 - 25:00, Tiempo de espera = 15:00, Temperatura = 200 °C, Enfriamiento = 30 min.
   PRECAUCIÓN: Tenga cuidado al trabajar con ácido nítrico, ya que éste y los humos generados al calentarlo son altamente corrosivos. El trabajo debe completarse en un espacio bien ventilado con equipo de protección personal completo, como bata de laboratorio, gafas/protector facial y guantes compatibles con el trabajo con ácido. Los pequeños volúmenes y el enfriamiento prolongado utilizado aquí minimizan un poco el riesgo, pero siempre se debe tener cuidado.
4. Transfiera las muestras digeridas a tubos cónicos libres de metal; luego, transfiera 300 μL a un tubo nuevo. Diluir a 10 mL usando 9.7 mL de agua ultrapura, lo que da como resultado una concentración de HNO₃ del 3% (v/v).
5. Prepare patrones de Fe de elementos individuales en concentraciones de 1000, 100, 1, 0,1 y 0 μg Fe/mL en HNO₃ % (v/v) y agua ultrapura. Prepare el patrón interno del elemento Y individual a una concentración de 1 μg/mL en HNO₃ (v/v) al 3% en agua ultrapura.
6. Analice muestras mediante ICP-OES. Para los modos axial y radial, seleccione las siguientes líneas de emisión para el análisis del contenido de hierro. Fe (234,350 nm), Fe (238,204 nm), Fe (259,940 nm) e Y (371,029 nm) utilizados para la estandarización interna.
7. Normalice los resultados a la cantidad de muestra utilizada para la entrada para calcular μg de Fe/g de tejido.

Resultados

En nuestros estudios terapéuticos in vivo anteriores, tratamos a ratones con una dosis de nanofármaco (10 mg de nanofármaco de Fe/kg de peso corporal del ratón) semanalmente durante varias semanas ^3,7,8. Para esta demostración, se buscó determinar si se podía observar acumulación de nanofármaco en metástasis pulmonares después de una dosis, 1 semana después. Los resultados d...

Discusión

Las nanopartículas tienen un gran potencial para el tratamiento del cáncer. Aquí, demostramos que un portador de MNP conjugado Cy5.5 puede llegar a los tejidos cancerosos para administrar oligonucleótidos terapéuticos en un modelo murino de cáncer de mama metastásico. La capacidad de administrar el nanofármaco de forma sistémica y al mismo tiempo lograr una acumulación considerable en los tejidos cancerosos ofrece enormes ventajas sobre muchos métodos de administración de ASO...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agilent 5800 ICP-OES	Agilent	5800 ICP-OES	For ICP-OES
Ammonium hydroxide	Thermo Fisher Scientific Inc	458680025	For nanodrug synthesis
Athymic nude "J:NU" mice	Jackson Laboratory	RRID:IMSR_JAX:007850	Immunocompromised mouse model
Betadine Surgical Scrub	Purdue	6761815101	For tumor resection
Cotton Tipped Applicators	Puritan	S-18991	For tumor resection
Crile Hemostats - Straight	F.S.T.	13004-14	For tumor resection
Cy5.5-NHS ester	Abcam	ab146455	For nanodrug synthesis
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	11995-065	For cell culture of MDA-MB-231
Eclipse 50i Clinical Microscope	Nikon	50i-B	For imaging of cryosections
Epichlorohydrin	Thermo Fisher Scientific Inc	117780250	For nanodrug synthesis
Extra Fine Graefe Forceps	F.S.T.	11150-10	For tumor resection and metastasis dissection
Fe standard	Inorganic Ventures	CGFE1-500ML	For ICP-OES
Fetal bovine serum	Corning	35-010-CV	For cell culture of MDA-MB-231
Fine Scissors - Sharp 10.5cm	F.S.T.	14060-10	For tumor resection and metastasis dissection
Flask (T-75)	Corning	430641U	For cell culture of MDA-MB-231
HNO3 nitric acid (70%, trace metal grade)	Fisher Chemical	A509P212	For ICP-OES
Insulin syringe 1 CC 29 G x 1/2"	Becton, Dickinson	324704	For tumor implant
Isoflurane	Covetrus	11695067772	For mouse anesthetization
Isoflurane vaporizer	SOMNI Scientific	VS6002	For mouse anesthetization
Isopropyl alcohol (70%) wipe	Cardinal	MW-APL	For tumor resection
IVIS SpectrumCT In Vivo Imaging System	PerkinElmer/Revvity	128201	For bioluminescence imaging
IVISbrite D-Luciferin Potassium Salt	PerkinElmer/Revvity	122799-100MG	For bioluminescence imaging
Ketofen (ketoprofen)	Zoetis	10004031	For tumor resection
Leica CM1950	Leica	CM1950	For cryosectioning of OCT-embedded samples
MARS 6 microwave digestion system	CEM	MARS 6	For ICP-OES
Matrigel, growth factor-reduced	Corning	354230	For tumor implant of MDA-MB-231
MDA-MB-231-luc-D3H2LN	PerkinElmer/Revvity	119369	For mouse model of spontaneous metastasis
Metal-free polypropylene 15 mL conical tubes	Labcon	31343450019	For ICP-OES
Microcentrifuge tube (1.7 mL)	DOT Scientific	RN1700-GMT	For metastasis sample collection
N-succinimidyl 3-[2-pyridyldithio]-propionate (SPDP)	Thermo Fisher Scientific Inc	21857	For nanodrug synthesis
PBS	Gibco	14190-144	For cell culture and tumor implant of MDA-MB-231
Penicillin-streptomycin	Gibco	15140-122	For cell culture of MDA-MB-231
Puralube vet ointment	MWI Veterinary	27505	For tumor resection
Sodium hydroxide	Thermo Fisher Scientific Inc	3728-70	For nanodrug synthesis
Tissue-Tek Cryomold Intermediate 15 x 15 x 5 mm	Sakura	4566	For metastasis sample collection
Tissue-Tek O.C.T. Compound	Sakura	4583	For metastasis sample collection
Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)	Thermo Fisher Scientific Inc	T2556	For nanodrug synthesis
Trypsin, 0.25%	Gibco	25200-056	For cell culture of MDA-MB-231
Vicryl PLUS (Antibacterial) violet 27" RB-1 taper	Ethicon	VCP303H	For tumor resection