Integración de la evaluación del comportamiento animal y la red neuronal convolucional para estudiar la interacción sabor-olor entre el wasabi y el alcohol

Resumen

Este artículo describe un conjunto de métodos para medir la capacidad supresora de inhalar bebidas alcohólicas en la sensación de escozor provocada por el wasabi.

Resumen

Las pastas comerciales de wasabi comúnmente utilizadas para la preparación de alimentos contienen un compuesto homólogo de isotiocianatos quimiosensoriales (ITC) que provocan una sensación irritante al consumir. Nunca se ha estudiado el impacto de inhalar bebidas alcohólicas dietéticas en la sensación de picante de wasabi. Si bien la mayoría de los estudios de evaluación sensorial se centran en alimentos y bebidas individuales por separado, existe una falta de investigación sobre el estudio olfativo de inhalar licor mientras se consume wasabi. Aquí, se desarrolla una metodología que combina el uso de un estudio de comportamiento animal y una red neuronal convolucional para analizar las expresiones faciales de ratones cuando huelen licor y consumen wasabi simultáneamente. Los resultados demuestran que el modelo de aprendizaje profundo entrenado y validado reconoce el 29% de las imágenes que representan el tratamiento conjunto de wasabi y alcohol pertenecientes a la clase del grupo wasabi-negativo-licor positivo sin necesidad de filtrado previo de materiales de entrenamiento. El análisis estadístico de las puntuaciones de la escala de muecas de ratón obtenidas de las imágenes de fotogramas de vídeo seleccionadas revela una diferencia significativa (P < 0,01) entre la presencia y la ausencia de licor. Este hallazgo sugiere que las bebidas alcohólicas dietéticas podrían tener un efecto decreciente en las reacciones provocadas por el wasabi en ratones. Esta metodología combinatoria tiene potencial para el cribado de compuestos individuales del ITC y el análisis sensorial de los componentes del aguardiente en el futuro. Sin embargo, se requieren más estudios para investigar el mecanismo subyacente de la supresión de la acritud del wasabi inducida por el alcohol.

Introducción

La wasabia japonica, comúnmente conocida como wasabi, ha ganado reconocimiento en la preparación de alimentos ^1,2. Es bien conocida la intensa experiencia sensorial que provoca al consumirla, caracterizada por lagrimeo, estornudos o tos. Esta acritud distintiva del wasabi puede atribuirse a un compuesto homólogo de isotiocianatos quimiosensoriales (ITC). Son fitoquímicos organosulfurados volátiles que se pueden clasificar en ω-alquenilo y ω-metiltioalquilo isotiocianatos³. Entre estos compuestos, el isotiocianato de alilo (AITC) es el producto ITC natural más predominante que se encuentra en plantas pertenecientes a la familia Cruciferae, como el rábano picante y la mostaza⁴. Las pastas comerciales de wasabi se preparan comúnmente a partir de rábano picante, lo que convierte al AITC en un marcador químico utilizado para el control de calidad de estos productos comerciales⁵.

El maridaje de bebidas alcohólicas dietéticas con platos con infusión de wasabi puede considerarse un ejemplo de disposición cultural⁶. Subjetivamente, esta combinación puede complementar el picante y el picante entre el wasabi y el licor, mejorando la experiencia culinaria en general. La evaluación cualitativa del comportamiento animal (QBA) es un enfoque metodológico integral que examina los cambios de comportamiento en los sujetos en respuesta a estímulos externos a corto o largo plazo utilizando términos numéricos⁷. Este método abarca pruebas de dolor, pruebas motoras, pruebas de aprendizaje y memoria, así como pruebas de emociones diseñadas específicamente para modelos de roedores⁸. Sin embargo, los estudios que investigan la evaluación sensorial sinérgica de la gustación junto con el olfato siguen siendo escasos en la literatura hasta ahora ^9,10. La mayoría de los estudios sobre la sensación quimiestésica se limitan a examinar el consumo individual de alimentos y bebidas por separado¹¹. En consecuencia, hay una escasez de investigación sobre la interacción sabor-olor que implica el acto de inhalar licor mientras se consume wasabi.

Dado que se cree que la sensación de picadura inducida por el wasabi es una forma de nocicepción¹², las evaluaciones del comportamiento animal son adecuadas para evaluar las respuestas sensoriales nociceptivas en animales roedores ^8,13,14. Langford et al.15,16 desarrollaron un método para evaluar la nocicepción en ratones, conocido como puntuación de la escala de muecas de ratón (MGS)^15,16. Este método de estudio conductual es un enfoque de evaluación relacionado con el dolor, que se basa en el análisis de las expresiones faciales exhibidas por los ratones experimentales. La configuración experimental es sencilla, ya que incluye una jaula transparente y 2 cámaras para la grabación de vídeo. Mediante la incorporación de tecnologías avanzadas 17,18,19 para la captura automática de datos, se pueden obtener medidas cuantitativas y cualitativas de comportamiento, mejorando el bienestar animal durante el monitoreo conductual ²⁰. En consecuencia, el MGS tiene el potencial de ser aplicado en el estudio de los efectos de diversos estímulos externos en animales de una manera ininterrumpida y ad libitum. Sin embargo, el proceso de puntuación solo implica la selección de unas pocas (menos de 10) imágenes de fotogramas de video para su evaluación por parte de los panelistas, y es necesaria una capacitación previa. Puntuar un gran número de imágenes de muestra puede ser laborioso. Para superar este desafío que requiere mucho tiempo, varios estudios han empleado técnicas de aprendizaje automático para predecir la puntuación MGS ^21,22. Sin embargo, es importante tener en cuenta que el MGS es una medida continua. Por lo tanto, un modelo de clasificación multiclase sería más adecuado para evaluar un problema lógico y categórico, como determinar si las imágenes de ratones ingiriendo wasabi y oliendo licor simultáneamente se parecen a las de ratones normales.

En este estudio se propuso una metodología para investigar la interacción gusto-olor en ratones. Esta metodología combina estudios de comportamiento animal con una red neuronal convolucional (CNN) para analizar las expresiones faciales de los sujetos ratones. Dos ratones fueron observados tres veces en condiciones normales de comportamiento, durante la experiencia de nocicepción inducida por wasabi y mientras inhalaban licor en una jaula específicamente diseñada. Las expresiones faciales de los ratones se grabaron en vídeo y las imágenes de fotogramas generadas se utilizaron para optimizar la arquitectura de un modelo de aprendizaje profundo (DL). A continuación, el modelo se validó utilizando un conjunto de datos de imágenes independiente y se desplegó para clasificar las imágenes adquiridas del grupo experimental. Para determinar el grado de supresión de la acritud del wasabi cuando los ratones inhalaron simultáneamente licor durante el consumo de wasabi, los conocimientos proporcionados por la inteligencia artificial se corroboraron aún más a través de la validación cruzada con otro método de análisis de datos, la puntuación MGS¹⁶.

Protocolo

En este estudio, se utilizaron dos ratones machos ICR de 7 semanas de edad que pesaban entre 17 y 25 g para la evaluación del comportamiento animal. Todos los procedimientos experimentales y de alojamiento fueron aprobados por el Comité de la Universidad Bautista de Hong Kong sobre el Uso de Sujetos Humanos y Animales en la Enseñanza y la Investigación. La sala de los animales se mantuvo a una temperatura de 25 °C y una humedad ambiental de 40%-70% en un ciclo de luz-oscuridad de 12 h.

1. Diseño de la jaula

1. Prepare ladrillos de estireno acrilonitrilo butadieno en 3 dimensiones diferentes para la construcción de jaulas: 8 mm x 8 mm x 2 mm, 16 mm x 16 mm x 6 mm y 32 mm x 16 mm x 6 mm.
2. Prepare una placa de acrilonitrilo butadieno estireno (312 mm x 147 mm x 2 mm) como base de la jaula.
3. Prepare una placa acrílica no transparente de 239 mm x 107 mm con un grosor de 2 mm para utilizarla como placa inferior.
4. Prepare una placa acrílica transparente de 239 mm x 107 mm con un grosor de 5 mm para utilizarla como placa superior.
5. Prepare una placa acrílica transparente de 107 mm x 50 mm con un grosor de 7 mm para utilizarla como placa terminal.
6. Construya 2 paredes laterales opacas apilando ladrillos a una altura de 54 mm.
7. Incruste las placas acrílicas en la jaula a base de acrilonitrilo butadieno estireno, como se ilustra en la Figura 1A.
8. Prepare una cámara de chows construida con cinco placas acrílicas transparentes de 90 mm x 50 mm con un grosor de 2 mm, como se ilustra en la Figura 1B. Entre las 5 placas acrílicas transparentes, use 2 placas para los lados, 1 placa para la parte superior, 1 placa para la parte inferior y 1 placa para el terminal.
9. Prepare una placa acrílica transparente de 60 mm x 50 mm y 2 mm como plato de introducción al chow y colóquelo en la cámara del chow.

2. Evaluación del comportamiento animal

1. Aloja a los compañeros de camada de 2 ratones machos ICR de 7 semanas juntos en una jaula normal.
2. Proporcione a los compañeros de camada de 2 ratones acceso libre a gránulos de comida y agua del grifo durante un período de adaptación de 1 semana.
3. Después de 1 semana, introduzca a los compañeros de camada de 2 ratones con una botella de etanol (~40% v/v).
   NOTA: Asegúrese de que solo se les permita inhalar o inhalar el etanol acuoso proporcionado ad libitum mientras se restringe el consumo de alcohol.
4. Realice experimentos de comportamiento utilizando el modelo de ratón de 9 a 10 semanas de edad y la jaula de cubículo transparente que se muestra en la Figura 1A.
5. Desmonte todas las placas acrílicas y las placas de acrilonitrilo butadieno estireno y límpielas a fondo. Comience enjuagándolos con agua ultrapura al menos 3 veces y luego séquelos con toallas de papel. A continuación, rocíelos con etanol al 75%, seguido de una limpieza con papel para lentes. Finalmente, déjalos secar al aire durante al menos 15 min.
6. Pesa a los ratones y registra sus pesos corporales antes de cada repetición del experimento conductual.
7. Prepara una mezcla de wasabi y mantequilla de cacahuete con un peso de 1 g de wasabi comercial y 4,5 g de mantequilla de cacahuete. Mézclalos en una bolsa de plástico con cierre.
   NOTA: Debido a la volatilidad de los isotiocianatos en el wasabi, es importante almacenar el wasabi comercial en un congelador a -20 °C.
8. Pese y proporcione dos pastas de 0,5 g de mantequilla de maní o una mezcla de wasabi y mantequilla de maní en el plato de introducción de comida, como se ilustra en la Figura 1B, C.
9. Coloque el plato de introducción de comida preparado en la cámara de los comidas, como se ilustra en la Figura 1B, C, para permitir que los 2 ratones tengan acceso ad libitum a la comida durante cada sesión de grabación de video.
10. Llene la ranura inferior con 30 mL de líquido, ya sea agua pura o licor (~42% v/v de etanol), para facilitar la inhalación simultánea, como se indica en la Figura 1B, C.
11. Comience a grabar usando las cámaras de 2 teléfonos inteligentes colocados en los soportes para teléfonos en cada terminal.
    NOTA: Las especificaciones de los videos son las siguientes: ancho de fotograma, 1920; altura del marco, 1080; velocidad de datos, 20745 kbps; velocidad de fotogramas, 30,00 fotogramas por segundo (fps).
12. Coloque con cuidado a los 2 compañeros de camada entrenados de ratones en la plataforma de estudio de comportamiento animal diseñada desde la parte superior y asegure rápidamente la jaula con la placa superior.
    NOTA: Asegúrese de que este paso se complete dentro de los 15 s.
13. Graba cada video durante 2-3 minutos.
    NOTA: Asegúrese de que toda la duración del experimento, desde la preparación de la mezcla de mantequilla de maní y wasabi hasta la finalización de la grabación de video, se limite a 5 minutos.
14. Repite todo el experimento 3 veces.
    NOTA: Asegúrese de que cada réplica del experimento esté separada durante al menos 6 h.
15. Imita diferentes escenarios.
    NOTA: Por ejemplo, en este trabajo, se utilizó un par de ratones en 4 grupos con 4 escenarios diferentes que se imitaron utilizando el entorno experimental descrito anteriormente. Estos escenarios incluyen el Escenario A para el estudio de antecedentes, el Escenario B para el estudio de control positivo, el Escenario C para el estudio de interacción sabor-olor entre el wasabi y el alcohol y el Escenario D para el estudio de control negativo. En la Tabla 1 se presenta un resumen de estos escenarios.

3. Reconocimiento de imágenes

Al igual que muchos estudios sobre el procesamiento de imágenes 23,24,25, se logró un modelo de clasificación mediante el entrenamiento de una CNN. El script para las operaciones DL se escribió en Python v.3.10 en Jupyter Notebook (anaconda3). Está disponible en el siguiente repositorio de GitHub: git@github.com:TommyNHL/imageRecognitionJove.git. Para construir y entrenar la CNN, se utilizaron bibliotecas de código abierto, incluyendo numpy v.1.21.5, seaborn v.0.11.2, matplotlib v.3.5.2, cv2 v.4.6.0, sklearn v.1.0.2, tensorflow v.2.11.0 y keras v.2.11.0. Estas bibliotecas proporcionaron las herramientas y la funcionalidad necesarias para desarrollar y entrenar CNN para el reconocimiento de imágenes.

1. Exporte una serie de imágenes de fotogramas de vídeo de los clips de vídeo recopilados para generar un conjunto de datos para el entrenamiento del modelo mediante el Jupyter Notebook proporcionado, denominado Step1_ExtractingAndSavingVideoFrameImages.ipynb.
2. Seleccione solo las imágenes con al menos 1 mouse consumiendo el pegado proporcionado. Se proporcionan ejemplos de las imágenes seleccionadas en la Figura complementaria 1, la Figura complementaria 2, la Figura complementaria 3, la Figura complementaria 4, la Figura complementaria 5, la Figura complementaria 6 y la Figura complementaria 7.
3. Realice el aumento de datos volteando horizontalmente las imágenes generadas mediante la implementación del script proporcionado en Jupyter Notebook, denominado Step2_DataAugmentation.ipynb.
4. Reserve los datos de imagen de cada segunda replicada para la validación externa del modelo CNN independiente. Utilice las imágenes de cada primera y tercera réplica para el entrenamiento y las pruebas del modelo interno.
5. Preprocese los datos de imagen utilizados en el modelado de CNN mediante la ejecución del script en Jupyter Notebook, denominado Step3_CNNmodeling_TrainTest.ipynb, incluido el cambio de tamaño de la imagen, la conversión de color negro y la normalización de la señal de imagen.
6. Divida los materiales de capacitación en conjuntos de datos internos de capacitación y prueba de forma aleatoria 8:2.
7. Inicialice la arquitectura de CNN. Diseñe el número de salidas de CNN en función del número de escenarios que se van a examinar.
   NOTA: Por ejemplo, en este estudio, la red neuronal fue designada para clasificar 3 clases. Asegúrese de que se ha compilado el script para controlar el desequilibrio de datos en el peso de la clase.
8. Encuentre la combinación de hiperparámetros que produce una pérdida mínima en las muestras de prueba internas para la construcción de CNN.
9. Adopte la combinación óptima de hiperparámetros para construir la arquitectura CNN.
10. Abra los Jupyter Notebooks proporcionados Step4_CNNmodel_ExternalValOriginal.ipynb y Step5_CNNmodel_ExternalValFlipped.ipynb. Validar el modelo obtenido utilizando las imágenes independientes (originales y volteadas) de la segunda réplica del experimento de comportamiento animal.
11. Implemente el modelo obtenido y validado para clasificar las imágenes de fotogramas de vídeo generadas a partir del grupo experimental mediante Jupyter Notebook Step6_CNNmodel_Application.ipynb.
    NOTA: Por ejemplo, es el escenario C en este trabajo.

4. Puntuación manual de la escala de muecas del ratón

NOTA: Para validar los insights proporcionados por la predicción del modelo CNN, se aplicó otro método previamente desarrollado y validado por Langford et al.¹⁶. Este método consiste en puntuar el MGS en función de las 5 unidades de acción facial (AU) específicas del ratón: estiramiento orbital, protuberancia de la nariz, protuberancia de las mejillas, endurecimiento de las orejas hacia afuera y cambio de bigotes. A cada AU se le asigna una puntuación de 0, 1 o 2, lo que indica la ausencia, la presencia moderada o la presencia obvia de la UA, respectivamente. Este sistema de puntuación permite cuantificar y escalar cada AU para evaluar el nivel de nocicepción o malestar experimentado por los ratones.

1. Captura 3 imágenes de fotogramas de vídeo de los compañeros de camada ingiriendo la pasta para cada clip de vídeo. Asegúrese de que cada fotograma esté separado por al menos 3 segundos.
2. Bloquee el código y reordene aleatoriamente las imágenes de diferentes clases de escenarios en secuencia utilizando el archivo de plantilla proporcionado denominado "shuffleSlides.pptm" (archivo complementario 1) y ejecutando el código de macro incrustado.
3. Invite al menos a 10 panelistas a puntuar las imágenes de muestra.
4. Entrene a los panelistas para que puntúen muestras de imágenes utilizando el MGS. Proporcionar a los panelistas materiales de capacitación que incluyan el artículo original sobre MGS y su manual^15,16.
5. Calcule la puntuación MGS de cada sujeto animal en un fotograma capturado promediando todos los puntos de puntuación de las 5 AU faciales correspondientes. Presentar la puntuación MGS como la media ± error estándar de medición (SEM).
6. Determine si existen diferencias estadísticamente significativas entre las diferentes clases de escenarios mediante el análisis de varianza unidireccional (ANOVA) con la prueba post-hoc de comparación múltiple de Bonferroni.
   NOTA: Un valor de P < 0,05 se considera estadísticamente significativo.

Resultados

El objetivo principal de este estudio es establecer un marco sólido para investigar la interacción gusto-olor en ratones. Este marco incorpora el uso de la inteligencia artificial y la QBA para desarrollar un modelo de clasificación predictiva. Además, los conocimientos obtenidos de DL se validan de forma cruzada con una evaluación cuantitativa de MGS para un análisis interno independiente. La aplicación principal de esta metodología es examinar el grado de supresión de la nocicepción invocada por el wasabi cua...

Discusión

El método propuesto para estudiar la interacción gusto-olfato en este trabajo se basa en el método original de codificación conductual para la expresión facial del dolor en ratones, que fue desarrollado por Langford et ^al.16. Varios artículos publicados recientemente han introducido CNN para el seguimiento automático de la cara del ratón y la posterior puntuación MGS 21,26,27,28.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absolute ethanol (EtOH)	VWR Chemicals BDH	CAS# 64-17-5
Acrylonitrile butadiene styrene bricks	Jiahuifeng Flagship Store	https://shop.paizi10.com/jiahuifeng/chanpin.html
Acrylonitrile butadiene styrene plates	Jiahuifeng Flagship Store	https://shop.paizi10.com/jiahuifeng/chanpin.html
Allyl isothiocyanate (AITC)	Sigma-Aldrich	CAS# 57-06-7
Anhydrous dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	CAS# 67-68-5
Chinese spirit	Yanghe Qingci	https://www.chinayanghe.com/article/45551.html
Commercial wasabi	S&B FOODS INC.	https://www.sbfoods-worldwide.com
Formic acid (FA)	VWR Chemicals BDH	CAS# 64-18-6
GraphPad Prism 5	GraphPad	https://www.graphpad.com
HPLC-grade acetonitrile (ACN)	VWR Chemicals BDH	CAS# 75-05-8
HPLC-grade methanol (MeOH)	VWR Chemicals BDH	CAS# 67-56-1
Microsoft Excel 2016	Microsoft	https://www.microsoft.com
Microsoft PowerPoint 2016	Microsoft	https://www.microsoft.com
Milli-Q water system	Millipore	https://www.merckmillipore.com
Mouse: ICR	Laboratory Animal Services Centre (The Chinese University of Hong Kong, Hong Kong, China)	N/A
Peanut butter	Skippy	https://www.peanutbutter.com/peanut-butter/creamy
Python v.3.10	Python Software Foundation	https://www.python.org
Transparent acrylic plates	Taobao Store	https://item.taobao.com/item.htm?_u=32l3b7k63381&id=60996545797 0&spm=a1z09.2.0.0.77572e8dFPM EHU