Imágenes moleculares de organoides cerebrales humanos mediante espectrometría de masas

Resumen

Se desarrolló un método avanzado para la obtención de imágenes por espectrometría de masas (MSI) de organoides cerebrales que permite mapear las distribuciones de metabolitos dentro de estos modelos. Esta tecnología ofrece información sobre las vías metabólicas del cerebro y las firmas de metabolitos durante el desarrollo temprano y en la enfermedad, lo que promete una comprensión más profunda de la función cerebral humana.

Resumen

Los modelos de organoides cerebrales sirven como una poderosa herramienta para estudiar el desarrollo y la función del cerebro humano. La espectrometría de masas (MSI), una tecnología de vanguardia, nos permite mapear la distribución espacial de diversas moléculas como lípidos, azúcares, aminoácidos, fármacos y sus metabolitos dentro de estos organoides, todo ello sin necesidad de sondas moleculares específicas. Los datos MSI de alta calidad dependen de una preparación meticulosa de las muestras. Los fijadores desempeñan un papel fundamental, pero las opciones convencionales como el glutaraldehído, el paraformaldehído y la criopreservación, como la sacarosa, pueden afectar inadvertidamente a los metabolitos tisulares. La fijación óptima implica la congelación instantánea en nitrógeno líquido. Sin embargo, en el caso de los organoides pequeños, un enfoque más adecuado consiste en la transición de los organoides directamente de la incubadora a una solución de inclusión calentada, seguida de la congelación en etanol refrigerado por hielo seco. Otro paso crítico es la inclusión antes de la criosección, que también requiere materiales compatibles con MSI, ya que las opciones tradicionales pueden interferir con la deposición y la ionización de la matriz. Aquí, se presenta un protocolo optimizado para MALDI-MSI de alta resolución de organoides cerebrales humanos, que abarca la preparación de muestras, el seccionamiento y la obtención de imágenes mediante espectrometría de masas. Este método muestra la distribución molecular de metabolitos pequeños, como los aminoácidos, con alta precisión y sensibilidad de masa. Como tal, junto con estudios complementarios de organoides cerebrales, puede ayudar a iluminar procesos complejos que gobiernan el desarrollo temprano del cerebro, las trayectorias del destino de las células metabólicas y las firmas distintivas de metabolitos. Además, proporciona información sobre las ubicaciones precisas de las moléculas dentro del organoide, enriqueciendo nuestra comprensión de la organización espacial de los modelos de organoides cerebrales en 3D. A medida que el campo continúa avanzando, se anticipa un número creciente de estudios que aprovechan MSI para profundizar en los organoides cerebrales y los sistemas biológicos complejos, profundizando así la comprensión de los aspectos metabólicos de la función y el desarrollo del cerebro humano.

Introducción

Los modelos de organoides, derivados de células madre de tejido primario, células madre embrionarias o células madre pluripotentes inducidas (iPSC)^1,2,3 han hecho avanzar la investigación en biología humana al ofrecer modelos tridimensionales que imitan de cerca las funciones específicas de los órganos, ayudando en el estudio del desarrollo humano, los mecanismos de las enfermedades y el descubrimiento de fármacos ^4,5. En este contexto, desentrañar las complejidades de los organoides cerebrales es fundamental para comprender el desarrollo cerebral tanto fisiológico como patológico ^6,7, lo que requiere tecnologías como la espectrometría de masas (MSI)^8,9. La MSI, a diferencia de la espectrometría de masas tradicional, permite el mapeo directo y sin etiquetas de cientos a miles de biomoléculas dentro de una sola sección de tejido, proporcionando información detallada sobre la distribución espacial de las moléculas (lípidos, péptidos, aminoácidos, fármacos y sus metabolitos) sin necesidad de sondas moleculares específicas^10,11. Además, las imágenes moleculares MSI se pueden registrar conjuntamente en secciones histológicas e inmunoteñidas, lo que proporciona una visión completa de la morfología del tejido, la especificidad celular y el contenido molecular.

El MSI es muy prometedor para la investigación de organoides, ya que ofrece información sobre las bases moleculares de las enfermedades, las relaciones genéticas-fenotípicas y las respuestas a los estímulos ambientales 12,13,14,15. En la industria farmacéutica, MSI facilita los análisis de absorción, distribución, metabolismo y eliminación de fármacos en modelos preclínicos^11,16. Además, ayuda a resolver sus metabolitos biotransformados, que pueden ser farmacológicamente activos¹⁷.

Entre los métodos MSI, predominan la desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI), la ionización por electrospray de desorción (DESI) y la espectrometría de masas de iones secundarios (SIMS) 9,18,19,20,21. De estos, MALDI-MSI destaca por su versatilidad, amplio rango de masas, capacidades de análisis directo y compatibilidad con varios compuestos químicos específicos de tejidos²². Sin embargo, a pesar de su potencial, la aplicación de MALDI-MSI en la investigación de organoides cerebrales sigue siendo poco explorada. Para abordar esta brecha, se ha introducido un protocolo personalizado para el análisis MALDI-MSI (HR-MALDI-MSI) de organoides cerebrales de alta resolución con el fin de optimizar la preservación de tejidos, la selección de matrices y las condiciones de imagen, lo que garantiza la adquisición confiable de datos de alta calidad¹⁵. Este protocolo detallado muestra las capacidades de HR-MALDI-MSI para proporcionar a los investigadores el arsenal adicional para aprovechar el poder de esta tecnología para explorar el panorama metabólico de los organoides con un detalle sin precedentes.

Protocolo

El desbordamiento general del protocolo se muestra en la Figura 1. Los detalles de los reactivos y el equipo utilizado en el estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Preparación de la sección de organoides cerebrales

1. Preparar organoides cerebrales (de 2-3 mm de tamaño cuando alcanzan los 30-60 días en cultivo) a partir de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) siguiendo los informes publicados previamente^23,24 y recogerlos en el momento deseado utilizando puntas de diámetro ancho.
   1. Lave los organoides preparados tres veces con 1x solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco sin CaCl₂ y MgCl₂ a temperatura ambiente para enjuagar el medio y luego muy rápidamente con agua destilada a temperatura ambiente para enjuagar las sales del DPBS.
2. Prepare el 10% de la solución de gelatina a partir de piel de pescado fría agitando y calentando la gelatina (10 mg en 100 mL de DPBS) a 70-80 °C durante 2 h, luego mueva la solución a la incubadora a 37 °C durante 30 min para eliminar las burbujas y equilibrar a la temperatura de la incubadora donde se cultivaron los organoides.
   NOTA: Se recomienda preparar gelatina fresca para cada experimento, pero se puede utilizar hasta por 1 semana (almacenar a 4 °C) si es necesario. La gelatina se solidificará a temperatura ambiente y debe calentarse antes de usarla como solución de inclusión para que se vuelva líquida.
3. Sujete el organoide en el centro de un molde de plástico (25 mm x 20 mm x 5 mm) con la punta de pipeta pequeña y vierta suavemente la solución de inclusión de gelatina al 10% en el molde hasta que el organoide esté completamente sumergido (el molde debe estar aproximadamente medio lleno).
   1. Coloque el molde en una placa de Petri sobre hielo seco que contenga etanol 100% frío para congelarlo rápidamente (1-2 min). Cuando esté completamente congelado, evidenciado por el cambio de color a blanco sólido, saque el bloque de organoide-gelatina de la placa de Petri, envuélvalo en papel de aluminio o colóquelo en una taza de hojalata, sellada para evitar la concentración de agua, y almacene a -80 ° C hasta que esté listo para la criosección.
4. Para la criosección, coloque los bloques de plástico que contienen organoides dentro de la cámara criogénica a -20 °C a -25 °C durante 10-15 minutos para equilibrarse con la temperatura de la cámara. Seccionar los organoides en secciones de 14 μm utilizando criotomo y montaje en descongelación en portaobjetos de vidrio recubiertos de óxido de indio y estaño (portaobjetos ITO) para MSI.
5. Escanee inmediatamente secciones estructuralmente uniformes en el espectrómetro de masas o séllelas en el contenedor y guárdelas a -80 °C para estudios posteriores.

2. Preparación y aplicación de matrices para MALDI-MSI

1. Para MALDI-MSI, rocíe los portaobjetos y cubra las secciones de tejido con la matriz, un compuesto orgánico que ayuda a ionizar diferentes metabolitos²⁵. Se utilizan diferentes matrices para obtener imágenes de diferentes especies de moléculas; Por lo tanto, en primer lugar, se debe elegir la matriz más adecuada para el estudio.
   NOTA: Este estudio se centró en la localización y distribución de metabolitos pequeños y aminoácidos relacionados con las vías metabólicas mitocondriales, y la matriz se eligió en consecuencia (para el mapeo de lípidos, consulte Cappuccio et al.)¹⁵ de la Constitución.
2. Primero, al sacar los portaobjetos ITO de -80 °C, coloque el portaobjetos inmediatamente en un desecador durante 20 minutos para minimizar la condensación de agua atmosférica en las superficies.
3. Prepare dihidrocloruro de N-(1-naftil) etilendiamina (NEDC), que es una matriz adecuada para metabolitos pequeños, ya que proporciona una señal fuerte del analito de interés sin interferir con las señales de fondo bajo el m/z de 500 Da²⁶. Rocíe 10 mg/mL de solución NEDC en metanol al 70% sobre las secciones de organoides después de la desecación del portaobjetos con un rociador neumático calentado.
4. Ajuste los parámetros del pulverizador de matriz de la siguiente manera: temperatura de la boquilla = 75 °C, velocidad de la boquilla = 1.250 mm/min, caudal de la bomba = 100 μL/min, número de pasadas = 8, distancia entre pistas = 2,5 mm, caudal de gas 3L/min, tiempo de secado = 10 s y presión de gas nitrógeno de 10 psi.

3. Instrumentación MALDI-MSI

1. Para lograr una plataforma MALDI-MSI de alta resolución para visualizar metabolitos de organoides cerebrales, monte una fuente de iones MALDI con una interfaz de embudo de iones duales en un espectrómetro de masas.
2. Utilice un láser Nd conectado con conmutación Q y frecuencia triplemente triplicada con una longitud de onda de 349 nm, una tasa de repetición de 1 kHz y una energía de pulso de aproximadamente 1,3-1,4 μJ.
3. Para evitar el sobremuestreo, enfoque el láser a un tamaño de punto de ~15 μm de diámetro.
4. Conecte la muestra a la platina del inyector MALDI. Opere y mantenga el embudo de iones de alta presión a 7.4-7.5 Torr, y mantenga el embudo de iones de baja presión a 1.6-1.8 Torr.
5. Aplique voltajes de radiofrecuencia de 604 kHz, 80 V0 pico y 780 kHz, 191 V0 pico a los embudos de iones de alta y baja presión, respectivamente.
6. Para mejorar la sensibilidad de metabolitos pequeños en el rango de masa baja, reduzca las amplitudes de RF en el embudo de baja y alta presión de la fuente MALDI-MSI a aproximadamente 20% y 15%, respectivamente.
7. Establezca la resolución de masa en 70.000. Seleccione el área y el tamaño de píxel (25 μm/píxel) que se medirá en el software del inyector MALDI.

4. Adquisición y análisis de datos MALDI-MSI

1. Adquiera datos en el rango m/z de 80-900 en modo de iones negativos y positivos. Escanee las muestras con una resolución lateral de 25 μm por píxel para secciones de organoides de 14 μm.
2. Establezca el tiempo de inyección de iones en el espectrómetro de masas en 250 ms y adquiera espectros de masas por transformada de Fourier (FTMS) en el modo de perfil mientras el control automático de ganancia (AGC) está desactivado²⁶.
3. Utilice los picos de la matriz NEDC como una calibración de masa interna en línea, lo que da como resultado una precisión de masa superior a ±5 ppm.
4. Utilice software compatible para procesar los datos. Importe los datos espectrales MSI directamente en el software, luego realice la corrección de la línea de base utilizando un algoritmo de convolución y normalice los datos utilizando el recuento total de iones (TIC).
5. Genere la lista de características de las imágenes de iones a partir de los archivos de datos sin procesar utilizando un ancho de bin de Δm/z = 0,01 o ±5 ppm para distinguir las imágenes m/z en función del defecto de masa y la cobertura de píxeles.
6. Genere imágenes en falso color (Jet) o RGB (rojo-verde y azul) a partir de especies individuales de iones metabolito. Cargue la lista m/z de archivos de datos brutos obtenidos de MALDI-MSI en la Base de Datos de Metaboloma Humano (HMDB) (tolerancia de masa <5 ppm en relación con el m/z teórico) para identificar metabolitos.
   NOTA: La masa exacta y la fórmula y estructura predichas del metabolito obtenidas a partir de los datos LC-MS/MS también se utilizan para consultar bases de datos metabolómicas (por ejemplo, HMDB, Metlin) para la comparación e identificación de metabolitos.

Resultados

A continuación, se muestra un protocolo que optimiza las imágenes moleculares (metabólicas) utilizando MSI (Figura 1, consulte también Cappuccio et al.)¹⁵. Los datos más fiables y la preservación de la morfología de los tejidos se lograron con gelatina al 10% de piel de pescado fría, confirmada por la tinción histológica de secciones seriadas. Utilizando gelatina de pescado incorporada a organoides cerebrales humanos de 60 días, los metabolitos relacionados con el ciclo de Krebs se mapearon utilizando MSI, demostrando su distribución espacial (Figura 2).

En general, el protocolo optimizado proporcionó resultados sólidos de manera consistente, con un 10% de gelatina de piel de pescado fría como material de inclusión preferido y configuraciones de pulverización de matriz NEDC ajustadas para mejorar la resolución de la imagen. Los pequeños metabolitos detectados en los organoides cerebrales proporcionan información valiosa sobre las complejidades moleculares de este tejido.

Figura 1: Línea general de estudio del metaboloma de organoides del cerebro humano. Los organoides derivados de los fibroblastos individuales a través de células madre pluripotentes inducidas se utilizan para LC-MS y MSI para resaltar la distribución espacial de los metabolitos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Mapeo de metabolitos relacionados con el ciclo de Krebs. Identificación y distribución de metabolitos relacionados con el ciclo de Krebs utilizando organoides de 60 días derivados de controles sanos utilizando MSI. Se muestra la tinción de hematoxilina y eosina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

El protocolo refinado para MALDI-MSI de alta resolución de organoides cerebrales humanos aborda meticulosamente los pasos fundamentales para garantizar la fiabilidad de los resultados. La conservación de las muestras se convierte en algo primordial y, para evitar el agrietamiento y el daño de los tejidos, se propone un método de congelación alternativo que consiste en una solución de inclusión calentada y etanol refrigerado por hielo seco. Este protocolo funciona mejor para tejidos del tamaño de un minuto, como los organoides del cerebro humano¹⁵. Se advierte contra los materiales de incrustación, como el compuesto de temperatura óptima de corte (OCT) y la inclusión de parafina fijada en formol (FFPE) debido a su interferencia con la deposición e ionización de la matriz. En cambio, la gelatina al 10% de piel de pescado fría se destaca como la solución de inclusión óptima, lo que demuestra su eficacia en la preservación de la integridad del tejido durante la criosección¹⁵. Además, la elección de la matriz y sus técnicas de deposición, como la pulverización en seco, es imprescindible para minimizar la deslocalización de metabolitos pequeños de bajo m/z y mejorar la resolución de la imagen.

La solidez y fiabilidad del protocolo están respaldadas por la exitosa detección y visualización de un amplio espectro de moléculas en organoides del cerebro humano¹⁵, lo que proporciona información inestimable sobre su distribución espacial y su posible importancia biológica. Estos hallazgos aumentan significativamente la comprensión del intrincado paisaje molecular dentro de los organoides cerebrales, dilucidando las vías de señalización fundamentales y los procesos metabólicos que sustentan el desarrollo y la función del cerebro.

Si bien los datos actuales proporcionan nuevos conocimientos sobre la localización de diversas especies, la fuente de imágenes MALDI del espectroglifo utilizada en este estudio aún no ha alcanzado la resolución a nivel de una sola célula (actualmente en ~ 10-20 μm). Otras plataformas, como timsTOF de Bruker y MRT de Water, pueden ofrecer una resolución de una sola célula a 5 μm, por lo que es importante tener en cuenta el instrumento que se utilizará para la experimentación.

A pesar de estas limitaciones, el HR-MALDI-MSI de alta resolución de los organoides cerebrales es muy prometedor. La capacidad de mapear las distribuciones de metabolitos y lípidos dentro de los organoides ofrece un punto único sobre las trayectorias del destino de las células metabólicas, las vías y las firmas distintivas cruciales para el desarrollo y la maduración de los organoides. Esta metodología sirve como puente entre la histología convencional y el análisis molecular, facilitando una comprensión más profunda de las interconexiones entre el genoma, el fenoma y las respuestas ambientales.

En resumen, el protocolo optimizado para HR-MALDI-MSI de organoides cerebrales humanos constituye un activo valioso para los investigadores que exploran modelos de organoides. Este método sienta las bases para una mayor elucidación de las complejidades moleculares que sustentan el desarrollo y la función del cerebro al abordar meticulosamente los pasos críticos, la resolución de problemas y el reconocimiento de las limitaciones. A medida que la tecnología MSI evoluciona y se vuelve cada vez más accesible, está preparada para avanzar en nuestra comprensión del desarrollo humano temprano, el modelado de enfermedades y el descubrimiento de fármacos.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
(1S, 2S)-1,2-di-1-Naphthyl-ethylenediamine dihydrochloride	Sigma-Aldrich (St. Louis, MIA)	1052707-27-3	Matrix substance for MALDI-MS, ≥99.0% (HPLC)
1× Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS)	Life Technologies, USA	14190-144	Without CaCl2 and MgCl2
ART Wide Bore Filtered Pipette Tips	Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA	2069G	Reduce potential contamination
Cryomolds	Tissue-Tek	25608-916	Standard mold with flat-surface
Entellan	Fisher Scientific	M1079610500	Cover slips
Eosin Y	Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)	E511-25	Certified Biological Stain
Fish gelatin	Sigma-Aldrich (St. Louis, MIA)	G7041	Powder form from cold water fish skin
Hematoxylin	Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)	517-28-2	Certified biological stain Elevated pressure imaging source with
HTX M5+ sprayer	HTX Technologies LLC, Carrboro, USA		Matrix sprayer
Indium tin	Hudson Surface Technology,	PL-IF-000010-P25	Provide a conductive surface for MALDI imaging
MALDI ion source	Spectroglyph LLC, USA		dual ion funnel interface
Methanol	Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)	67-56-1	HPLC grade
oxide (ITO) conductive–coated slides	New York, United States
Porcine gelatin	Sigma-Aldrich (St. Louis, MIA)	G1890	Powder form from porcine skin
Q-Exactive mass spectrometer	Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA		High resolution mass spectrometry
SCiLS Lab software	version 2024a Pro		for processing the data
Water	Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)	W6500	HPLC grade
	(Waltham, MA, USA)