Detección eficaz de células poblacionales del lado de Hoechst mediante citometría de flujo

Resumen

Aquí, demostramos que los láseres de alta potencia de 375 nm y 405 nm pueden excitar eficazmente Hoechst 33342 y servir como una alternativa viable al láser de 355 nm para la detección de células de población lateral (SP), ampliando así la gama de láseres disponibles en aplicaciones de citometría de flujo.

Resumen

Las células de la población lateral (SP) se identifican mediante tinción de Hoechst 33342 y se analizan mediante citometría de flujo (FCM). El método SP de Hoechst se utiliza para el aislamiento de células madre en función de las propiedades de eflujo de colorante de los transportadores de casetes de unión a ATP (ABC). El método se empleó inicialmente para la identificación y el aislamiento de células madre hematopoyéticas (HSC), pero ahora ha evolucionado para centrarse principalmente en la identificación y el aislamiento de células madre cancerosas (CSC). El método de detección tradicional de FCM utiliza un láser de 355 nm para excitar el tinte y detectar células SP. A través de este estudio, hemos identificado con éxito enfoques alternativos para la excitación del colorante que pueden reemplazar eficazmente la detección de células SP utilizando un láser de 355 nm. Esto se logra mediante la utilización de láseres de alta potencia de 375 nm o 405 nm. Esto nos permite ejercer una selectividad mejorada en la detección de células SP en lugar de limitarnos únicamente a la citometría de flujo láser de 355 nm.

Introducción

Las células de la población lateral (SP) se identifican mediante tinción de Hoechst 33342 y se analizan mediante citometría de flujo (FCM). Las células SP se caracterizan por el bombeo del tinte de ADN fluorescente fuera de las células a través de su transportador de casete de unión a ATP (ABC) ^1,2. El método se estableció originalmente para aislar células madre hematopoyéticas (HSC) de médula ósea murina1^. Las células SP de médula ósea se enriquecieron con una población de HSCs caracterizadas por CD117⁺Sca-1^{+Lin-Thy1 de baja} expresión ^3,4. A partir de entonces, el método se utilizó ampliamente para aislar y enriquecer células madre de otros tejidos, como el músculo cardíaco⁵, el hígado⁶, el pulmón⁷, el riñón⁸ y el prosencéfalo⁹. En particular, el método se ha aplicado para aislar células madre cancerosas (CSC) en la última década. Las CSC representan una pequeña población de células que poseen las propiedades de iniciación tumoral, autorrenovación, resistencia a la quimioterapia y potencial metastásico¹⁰. Las CSC se identificaron inicialmente en neoplasias malignas hematopoyéticas¹¹ y posteriormente se observaron en varios tumores sólidos como los carcinomas de próstata¹², ovario¹³,¹⁴ gástrico,¹⁵ de mama y pulmón¹⁶. A pesar de la disponibilidad de varias técnicas para la identificación de CSC, la técnica SP sigue siendo una opción preferida debido a su amplia aplicabilidad en diversos tejidos y líneas celulares. Además, es una técnica valiosa que aísla CSCs utilizando la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS)16,17,18. Los hallazgos experimentales demuestran que las células SP exhiben una tumorigénesis pronunciada y muestran niveles elevados de expresión de genes asociados a células madre^19,20. Nuestro estudio previo²¹ también ha demostrado que el análisis transcriptómico de células SP aisladas en mieloma múltiple revela un enriquecimiento de las vías de señalización asociadas con las células madre, como la vía del erizo. Mientras tanto, realizamos análisis de enriquecimiento de vías sobre los genes expresados diferencialmente en las células SP de la leucemia mielógena aguda²². Los genes alterados se enriquecieron en vías relacionadas con las células madre (Wnt/β-catenina, TGF-β, Hedgehog, Notch). Encontramos que las células SP 1 x 10⁵ podían formar tumores en ratones BALB/c nulos²², mientras que las células no SP no podían, lo que indica que las células SP tenían características de células madre de leucemia. La eficacia del método Hoechst SP en la identificación de CSCs es evidente.

El protocolo SP de Hoechst se ha perfeccionado y mejorado a lo largo de la investigación. El protocolo implica un control estricto de la concentración de colorante, la densidad celular, la temperatura y la duración de la incubación, la composición del tampón y el valor de pH. Las muestras de células preparadas de acuerdo con este protocolo se sometieron a análisis de citometría de flujo. Debido a la excitación del colorante de Hoechst con un láser UV a 355 nm y a la detección de su emisión de fluorescencia utilizando un filtro de 690/50 nm (Hoechst Red) y un filtro de 450/50 nm (Hoechst Blue), se requiere un láser de 350 nm para FCM. Sin embargo, los láseres de 350 nm no suelen equiparse en la mayoría de los FCM debido a su alto coste. Por lo tanto, intentamos encontrar un enfoque alternativo para la excitación del colorante para la detección efectiva de células SP mediante citometría de flujo. En este estudio, se evaluó la capacidad de los láseres de 375 nm y 405 nm para detectar células SP y se comparó con la del láser de 355 nm. Nuestros hallazgos demuestran una notable similitud entre las células SP detectadas por los láseres de 355 nm, 375 nm y 405 nm. Estos resultados sugieren que los láseres de alta potencia de 375 nm y 405 nm pueden servir como alternativas viables al láser de 355 nm para la detección de células SP. La inclusión de fuentes de luz de excitación adicionales para Hoechst 33342 facilita el uso de más modelos de citometría de flujo.

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Protocolo

Los experimentos de este estudio utilizaron un total de 10 ratones C57BL/6 de entre 8 y 12 semanas de edad. Las operaciones experimentales se llevaron a cabo de acuerdo con un protocolo que fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Sichuan (#201609309). Los materiales experimentales y los parámetros de citometría de flujo utilizados en este artículo se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Aislamiento y recolección de células de médula ósea de ratón

1. Eutanasia de ratones en estricta conformidad con las directrices institucionales. Para inducir la inconsciencia en el ratón, administre anestésicos inhalatorios comenzando con isoflurano al 2%, seguido de un aumento gradual de la dosis a isoflurano al 5% hasta el cese de la respiración.
2. Disecciona los ratones en el quirófano o en la vitrina de gases. Limpiar y esterilizar los ratones con etanol al 70%.
3. Corta completamente la piel y el músculo de la pierna con unas tijeras afiladas y disecciona los fémures.
4. Triture el fémur suavemente con una varilla de molienda en un mortero y enjuague las células de la médula ósea con medio DMEM hasta que el hueso se vuelva blanco.
5. Filtre las células de médula ósea obtenidas con un filtro de 100 μm en tubos de 15 mL. Centrifugar a 800 x g durante 5 min a 4 °C.
6. Deseche el sobrenadante y lise los glóbulos rojos residuales con 1 ml de tampón de lisis de glóbulos rojos durante 1 min a 4 °C. Centrifugar a 800 x g durante 5 min a 4 °C. Después de la centrifugación, lavar de nuevo con medio DMEM.
7. Vuelva a suspender las células en 2 mL de solución de incubación (medio DMEM + 5% FBS), cuente las células con un contador automático de células y ajuste la concentración celular a 1,0 x 10⁶ células/mL con solución de incubación.

2. Tinción celular

1. Complemente 2 mL de suspensión de células de médula ósea de cada ratón con 5 μg/mL de Hoechst 33342. A otra alícuota de 1 mL, añadir 100 μM de verapamilo como control negativo.
2. Incubar en un baño de agua a 37 °C durante 90 min con agitación suave cada 30 min.
3. Después de la incubación, enfríe las células en hielo durante 5 min y luego centrifuga a 250 x g durante 5 min a 4 °C. Vuelva a suspender las células en una solución de funcionamiento en frío (HBSS + 2% FBS). Centrifugar a 4 °C durante 5 min y desechar el sobrenadante.
4. Vuelva a suspender el pellet celular resultante en 500 μL de solución corriente por muestra. Antes del análisis de FCM, suplementar las células con 2 μg/mL de yoduro de propidio (PI) y colocarlas en hielo durante aproximadamente 5 min.

3. Citometría de flujo

NOTA: Para obtener un resumen de los diversos sistemas y configuraciones utilizados, consulte la Tabla 1.

1. Calibrar los valores del coeficiente de variación (CV) de los canales requeridos utilizando fluorosferas de control de calidad (QC) diario en los FCM y realizar pruebas de muestra después de completar con éxito el control de calidad.
   1. Seleccione el acceso directo del software del escritorio e inicie el software.
   2. Seleccione Iniciar control de calidad/estandarización en el menú Control de calidad/Estandarización para acceder al experimento de control de calidad.
   3. Inserte el tubo de muestra de fluorosferas QC en el soporte del tubo.
   4. Seleccione Iniciar para cargar el ejemplo y comenzar a ejecutar el procedimiento de control de calidad. Los FCM están listos para su uso después de que se apruebe el control de calidad.
2. Excite el colorante Hoechst 33342 de las mismas muestras con un láser de 355 nm, 375 nm y 405 nm, respectivamente, para la detección del rojo de Hoechst en el canal de 690/50 nm y del azul de Hoechst en el canal de 450/50 nm.
   1. Para crear un nuevo experimento, seleccione Nuevo experimento en el menú Archivo, especifique la ruta del archivo y guarde el experimento.
   2. Seleccione Establecer canal en el menú Configuración. Seleccione la casilla de verificación de señal de canal (Y585, V450, V660, NUV450, NUV660, UV450, UV660) y, a continuación, añada el nombre del reactivo en la columna Etiqueta (Y585: PI; V450: Azul Hoechst-405 nm; V660: Hoechst rojo-405 nm; NUV450: Azul Hoechst-375 nm; NUV660: Azul Hoechst-375 nm; UV450: Azul Hoechst-355nm; UV660: Azul Hoechst-355 nm).
   3. Haga clic en los iconos Pseudo Trazados de color en el área de trazado para crear trazados. Seleccione un nombre de eje para cambiar el canal que se muestra.
   4. Haga clic en Agregar tubo en la pantalla Tubo de ensayo para crear nuevos tubos de muestra y cambiar sus nombres.
   5. Seleccione Ejecutar para cargar la muestra, ver las gráficas y establecer las puertas. Ajuste la configuración de ganancia y umbral. Seleccione Grabar para guardar los datos.
3. Diseñe la lógica de configuración de la puerta.
   1. Para el primer trazado, haga clic en el eje X para seleccionar FSC-W y haga clic en el eje Y para seleccionar FSC-A. Seleccione Puerta poligonal para dibujar la puerta A para rodear la celda individual y excluir las celdas adherentes (Figura 1A).
   2. Para el segundo trazado, haga clic en el eje X para seleccionar FSC-A y haga clic en el eje Y para seleccionar SSC-A. Seleccione Puerta poligonal para dibujar la puerta B para separar las celdas no fragmentarias y excluir los desechos celulares (Figura 1B).
   3. Para el tercer gráfico, haga clic en el eje X para seleccionar PI-A y haga clic en el eje Y para seleccionar SSC-A. Seleccione la puerta del polígono para dibujar la puerta D. Seleccione las células vivas que exhiben PI negativo (Figura 1C) y dibuje la puerta C para obtener células vivas.
   4. Para el cuarto gráfico bidimensional, haga clic en el eje X para seleccionar Hoechst Red y haga clic en el eje Y para seleccionar Hoechst Blue. Haga clic con el botón derecho en el gráfico y seleccione Propiedad en el menú desplegable. Seleccione Formato lineal f o ambosel eje X y el eje Y. Seleccione Puerta poligonal para dibujar la puerta SP para obtener celdas SP (Figura 1D).
4. Para evaluar la elegibilidad de la muestra, utilice 355 nm de un citómetro de flujo^{específico 23} para la detección de células SP.
5. Utilice los láseres de 355 nm (potencia del láser: 20 mW) y 405 nm (potencia del láser: 80 mW) simultáneamente para detectar tanto las células de control (con verapamilo añadido) como las células experimentales.
6. Adquiera señales de fluorescencia en los canales de 690/50 nm y 450/50 nm correspondientes a los dos láseres. Observe la estimulación efectiva del colorante Hoechst 33342 mediante láseres de 355 nm y 405 nm con células SP claras (Figura 2B-C).
7. Para las mismas muestras, utilice los láseres de 375 nm (potencia del láser: 60 mW) y 405 nm (potencia del láser: 80 mW) para la detección de células.

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Resultados

En la Figura 2, el grupo de control fue tratado con verapamilo, que bloquea los transportadores ABC en las células madre para evitar la eliminación de Hoechst 33342. De este modo, las células madre del grupo no verapamilo expulsan Hoechst 33342 y forman una población de células negativas conocidas como células SP. El láser de 355 nm excitó eficazmente el colorante Hoechst 33342, lo que resultó en una observación clara de las células SP de la médula ósea (Fig...

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Discusión

Utilizamos el protocolo descrito para llevar a cabo tres experimentos, con cada ensayo con 3-4 ratones, lo que resultó en un total de 10 ratones. La proporción de células SP osciló entre el 0,05% y el 0,76%. Es importante tener en cuenta que se observaron variaciones individuales entre los ratones. Utilizamos cuatro citómetros de flujo para analizar las muestras de Hoechst. Se observa que la excitación del colorante de Hoechst por un láser de 20 mW a 355 nm en la nueva versión de la citometría de flujo es equiva...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Automatic cell counter	Countstar	1M1200
Cell Filter(100 µm)	BIOFIL	CSS-013-100
Daily quality control fluorospheres	Beckman Coulter	B5230
Dulbecco's Modification of Eagle's Medium with 4.5g/L glucose (DMEM medium)	CORNING	10-013-CVRC
Fetal bovine serum	CORNING	35-081-CV
HBSS	Hyclone	SH30030.02
Hoechst 33342	Sigma-Aldrich	B2261
Propidium iodide (PI)	Sigma-Aldrich	P4170
Red blood cell lysis buffer	Beyotime	C3702
Verapamil	Sigma-Aldrich	V4629