Ensamblaje de organoides de la retina con microglía

Resumen

La microglía es una célula inmunitaria residente única en la retina que desempeña un papel crucial en diversas enfermedades degenerativas de la retina. La generación de un modelo de cocultivo de organoides retinianos con microglía puede facilitar una mejor comprensión de la patogénesis y el progreso del desarrollo de las enfermedades de la retina.

Resumen

Debido a la accesibilidad limitada de la retina humana, los organoides retinianos (RO) son el mejor modelo para estudiar la enfermedad de la retina humana, que podría revelar el mecanismo del desarrollo de la retina y la aparición de la enfermedad de la retina. La microglía (MG) son macrófagos residentes únicos en la retina y el sistema nervioso central (SNC), que cumplen funciones inmunitarias cruciales. Sin embargo, los organoides de la retina carecen de microglía ya que su origen de diferenciación es el saco vitelino. La patogenia específica de la microglía en estas enfermedades de la retina sigue sin estar clara; Por lo tanto, resulta necesario el establecimiento de un modelo de organoide retiniano incorporado a la microglía. Aquí, construimos con éxito un modelo de cocultivo de organoides de retina con microglía derivada de células madre humanas. En este artículo, diferenciamos la microglía y luego la cocultivamos en organoides retinianos en la etapa inicial. Como incorporación de células inmunitarias, este modelo proporciona una plataforma optimizada para el modelado de enfermedades de la retina y el cribado de fármacos para facilitar la investigación en profundidad sobre la patogénesis y el tratamiento de las enfermedades relacionadas con la retina y el SNC.

Introducción

Como fuente limitada de la retina humana, la diferenciación de las células madre humanas en organoides retinianos tridimensionales (3D) representa un modelo in vitro prometedor para simular la retina¹. Contiene diferentes tipos de células en la retina, incluidos fotorreceptores, células ganglionares de la retina, células bipolares, células de Müller, células horizontales y astrocitos². Este modelo permite emular y estudiar tanto los mecanismos de desarrollo de la retina como la patogénesis de las enfermedades de la retina. Sin embargo, debido al método de diferenciación direccional, los organoides de la retina s....

Protocolo

Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética Institucional del Hospital Tongren de Pekín, Universidad Médica de la Capital. La línea celular H9 de HESC pertenecía al Instituto de Investigación WiCell. Precalentar el medio de cultivo celular a temperatura ambiente (RT) durante 30 minutos antes del experimento.

1. Generación de microglía humana

1. Cultive las hESC en medio de células madre hasta que la densidad celular alcance el 80%-90%. Siembre al menos 1 x 10⁶ celdas en cada pocillo.
2. Aspire el medio de células madre y enjuague las células con 1x DPBS (1 mL/pocillo de la placa de 6 pocillos).....

Discusión

Debido a la disponibilidad restringida de la retina humana, nuestra comprensión actual de las respuestas inflamatorias de la retina casi proviene de modelos animales. Para superar esta limitación, se diferenciaron los organoides de la retina. El desarrollo de modelos de organoides retinianos ha sido un área activa de investigación, con el objetivo de recapitular la complejidad de la retina humana para el modelado de enfermedades y el desarrollo terapéutico. Varios estudios han reportado la generación exitosa de org.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acctuase	Stemcell Technologies	07920
Advanced DMEM/F12	Thermo	12634-010
Anti-CRX(M02)	abnova	H00001406-M02	Antibody; dilution as per the manufacturer's instructions
Anti-IBA1	Abcam	ab5076	Antibody; dilution as per the manufacturer's instructions
B27	Life Technologies	17105-041
Dispase (1U/mL)	Stemcell Technologies	07923
DMEM basic	Gibco	10566-016
DMEM/F12	Gibco	10565-042
DPBS	Gibco	C141905005BT
EDTA	Thermo	15575020
F12	Gibco	11765-054
FBS	Biological Industry	04-002-1A
Gelatin	Sigma	G7041-100G	Solid
Glutamax	Gibco	35050-061
H9 cell line	WiCell Research Institute
IL-3	RD Systems	203-IL-050
IL-34	PeproTech	200-34-50UG
KSR	Gibco	10828028
Matrix	Corning	356231
M-CSF	RD Systems	216-MC-500
MEM Non-essential Amino Acid Solution	Sigma	M7145
N2	Life Technologies	17502-048
Neurobasal	Gibco	21103-049
Pen/strep	Gibco	15140-122
Stem cell medium	Stemcell Technologies	5990
Taurine	Sigma	T-8691-25G
X-ViVO	LONZA	04-418Q
Y27632	Selleck	S1049
β-mercaptoethanol	Life Technologies	21985-023