La ablación celular con láser en larvas intactas de Drosophila revela una competencia sináptica

Resumen

Este protocolo demuestra la ablación celular con láser de neuronas individuales en larvas intactas de Drosophila . El método permite estudiar el efecto de la reducción de la competencia entre neuronas en el sistema nervioso en desarrollo.

Resumen

El protocolo describe la ablación de una sola neurona con un sistema láser de 2 fotones en el sistema nervioso central (SNC) de larvas intactas de Drosophila melanogaster. Con este método no invasivo, el sistema nervioso en desarrollo puede manipularse de una manera específica para cada célula. La interrupción del desarrollo de las neuronas individuales en una red se puede utilizar para estudiar cómo el sistema nervioso puede compensar la pérdida de información sináptica. Las neuronas individuales fueron ablacionadas específicamente en el sistema de fibras gigantes de Drosophila, con un enfoque en dos neuronas: la fibra gigante presináptica (GF) y la neurona motora tergotrochanteral postsináptica (TTMn). El GF hace sinapsis con el TTMn ipsilateral, que es crucial para la respuesta de escape. La ablación de uno de los GF en el tercer estadio del cerebro, justo después de que el GF comienza el crecimiento axonal, elimina permanentemente la célula durante el desarrollo del SNC. El GF restante reacciona al vecino ausente y forma un terminal sináptico ectópico con el TTMn contralateral. Este terminal atípico, bilateralmente simétrico, inerva ambos TTMns, como se demuestra mediante el acoplamiento de colorantes, e impulsa ambas neuronas motoras, como se demuestra mediante ensayos electrofisiológicos. En resumen, la ablación de una sola interneurona demuestra la competencia sináptica entre un par bilateral de neuronas que puede compensar la pérdida de una neurona y restaurar las respuestas normales al circuito de escape.

Introducción

La ablación láser es una herramienta preferida para diseccionar circuitos neuronales en una amplia variedad de organismos. Desarrollado en sistemas genéticos modelo como gusanos y moscas, se ha aplicado en todo el reino animal para estudiar la estructura, la función y el desarrollo del sistema nervioso ^1,2,3. Aquí, la ablación de una sola neurona se empleó para investigar cómo interactúan las neuronas durante el ensamblaje del circuito en Drosophila. El sistema de escape de la mosca es uno de los circuitos favoritos para el análisis porque contiene las neuronas más g....

Protocolo

Todos los animales utilizados para el protocolo fueron de la especie Drosophila melanogaster. No hay problemas éticos en torno al uso de esta especie. No era necesaria la autorización ética para llevar a cabo este trabajo. Los detalles de las especies de Drosophila , los reactivos y el equipo utilizado en el estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Cría de Drosophila y selección del estadio larvario correcto

1. Elija una línea controladora Gal4 que impulse la expresión en las células que se van a ablacionar y recombínela con una línea reportera UAS-GFP o la cruce c....

Discusión

La ablación celular con un microscopio de 2 fotones demostró ser un método muy exitoso para manipular el desarrollo de circuitos neuronales en Drosophila. Dado que este método no es invasivo, causa un daño mínimo al animal. Los datos respaldan la utilidad de esta manipulación específica de la célula de circuitos conocidos.

Crucial para el éxito de la ablación fue la selección del controlador Gal4 más adecuado. Dado que el GFS está bien estudiado, se han descrito muchas l.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 488 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jaxkson ImmunoResearch	111-545-003
Anti-green fluorescent protein, rabbit	Fisher Scientific	A11122	1:500 concentration
Apo LWD 25x/1.10W Objective	Nikon	MRD77220	water immersion long working distance
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	B4287-25G
Chameleon Ti:Sapphire Vision II Laser	Coherent
Cotton Ball	Genesee Scientific	51-101
Dextra, Tetramethylrhodamine, 10,000 MW, Lysine Fixable (fluoro-Ruby)	Fisher Scientific	D1817
Drosophila saline			recipe from Gu and O'Dowd, 2006
Ethyl Ether	Fisher Scientific	E134-1	Danger, Flammable liquid
Fly food B (Bloomington recipe)	LabExpress	7001-NV
Methyl salicylate	Fisher Scientific	O3695-500
Microcentrifuge tube 1.5 mL	Eppendorf	22363204
Microscope cover-slip 18x18 #1.5	Fisher Scientific	12-541A
Neurobiotin Tracer	Vector Laboratories	SP-1120
Nikon A1R multi-photon microscope	Nikon		on an upright FN1 microsope stand
NIS Elements Advanced Research	Nikon		Acquisition and data analysis software
Paraformaldehyde (PFA)	Fisher Scientific	T353-500
PBS (Phosphate Buffered Salin)	Fisher BioReagents	BP2944-100	Tablets
R91H05-Gal4	Bloomington Drosophila Stock Center	40594
shakB(lethal)-GAl4	Bloomington Drosophila Stock Center	51633
Superfrost microscope glass slide	Fisher Scientific	12-550-143
Triton X-100	Fisher Scientific	422355000	detergent solution
UAS-10xGFP	Bloomington Drosophila Stock Center	32185