Aislamiento mitocondrial robusto del tejido cardíaco de roedores

Resumen

Los estudios bioenergéticos y metabolómicos de las mitocondrias han revelado su papel multifacético en muchas enfermedades, pero los métodos de aislamiento de estos orgánulos varían. El método detallado aquí es capaz de purificar mitocondrias de alta calidad a partir de múltiples fuentes de tejidos. La calidad se determina mediante las proporciones de control respiratorio y otras métricas evaluadas con respirometría de alta resolución.

Resumen

El aislamiento mitocondrial se ha practicado durante décadas, siguiendo los procedimientos establecidos por pioneros en los campos de la biología molecular y la bioquímica para estudiar las deficiencias metabólicas y las enfermedades. Es necesaria una calidad mitocondrial constante para investigar adecuadamente la fisiología mitocondrial y la bioenergética; Sin embargo, hay muchos métodos de aislamiento diferentes publicados disponibles para los investigadores. Aunque las diferentes estrategias experimentales requieren diferentes métodos de aislamiento, los principios y procedimientos básicos son similares. Este protocolo detalla un método capaz de extraer mitocondrias bien acopladas de una variedad de fuentes de tejidos, incluidos animales pequeños y células. Los pasos descritos incluyen la disección de órganos, la purificación mitocondrial, la cuantificación de proteínas y varios controles de calidad. La principal métrica de control de calidad utilizada para identificar mitocondrias de alta calidad es el índice de control respiratorio (RCR). El RCR es la relación entre la frecuencia respiratoria durante la fosforilación oxidativa y la tasa en ausencia de ADP. Se discuten métricas alternativas. Si bien con este protocolo se obtienen valores altos de RCR en relación con su fuente de tejido, se pueden optimizar varios pasos para satisfacer las necesidades individuales de los investigadores. Este procedimiento es robusto y ha dado lugar sistemáticamente a mitocondrias aisladas con valores de RCR superiores a la media en modelos animales y fuentes de tejidos.

Introducción

Las mitocondrias son orgánulos subcelulares que establecen condiciones energéticas citoplasmáticas optimizadas para funciones celulares específicas. Si bien los estudios a nivel celular, de tejidos y de organismos pueden proporcionar información sobre la función mitocondrial, el aislamiento de los orgánulos ofrece un nivel de control experimental que no sería posible de otra manera. Los aislamientos mitocondriales se han realizado desde la década de 1940, lo que permite estudios mecanicistas del metabolismo y la respiración en una variedad de células y tejidos ^1,2. La relevanc....

Protocolo

El uso y tratamiento de todos los animales vertebrados se realizó de acuerdo con los protocolos aprobados, revisados y aceptados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad Estatal de Michigan. Este protocolo se diseñó utilizando cobayas albinas Hartley macho y hembra y ratas Sprague Dawley (SD). Para el aislamiento de mitocondrias cardíacas de cobayas, los animales fueron sacrificados a edades comprendidas entre 4-6 semanas (300-450 g). Las mitocondrias cardíacas de ratas SD de ambos sexos se obtuvieron entre las 10-13 semanas de edad (250-400 g). Las recetas de tampones se describen en la

Discusión

El cumplimiento de los métodos descritos de manera concisa en este protocolo asegurará el aislamiento de las mitocondrias bien acopladas del tejido cardíaco de pequeños roedores, además de otros tipos de tejidos y fuentes. En general, el proceso debe durar un total de 3-3,5 h, durante las cuales todos los tejidos, muestras y aislados animales deben permanecer en hielo a 4 °C tanto como sea posible para limitar la degradación. Este procedimiento es robusto y puede modificarse de va.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.7 mL microcentrifuge tubes
10 mL glass beaker			For organ disection and mincing
50 mL centrifuge tubes			Centrifugation
Adenosine 5'-diphosphate monopotassium salt dihydrate	Sigma	A5285	Respirometry assays
BSA Protein Assay Kit	Thermo Scentific	PI23225	Mitochondrial protein quantification
Dextrose	Sigma	DX0145	For buffer (CB)
Ethylene glycol-bis(2-amino-ethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid	Sigma	E4378	For buffers (CB and IB) and respirometry assays
Glass cannula	Radnoti		Guinea pig and rat heart perfusion
Heparin sodium porcine mucosa	Sigma	SRE0027-250KU	Animal IP injection
High-resolution respirometer			Clark-type electrode; oxygraph with 2 mL chambers
Induction chamber
Isoflurane	Sigma	792632	Anesthetic
L-malic acid	Sigma	02288-50G	Respirometry assays
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma	M9272	For buffer (RB)
Mannitol	Sigma	MX0214	For buffer (IB)
Microliter syringes			Sizes ranging from 5–50 µL
Microplate reader			Must be able to incubate at 37 °C
MOPS	Sigma	475898	For all buffers
O2 tank
OMNI THQ Homogenizer	OMNI International	12-500	Similar rotor stator homogenizers will work
pipettes			Volumes of  2–20 µL; 20–200 µL; 200–1000 µL
Potassium chloride	Sigma	P3911	For buffers (RB and CB)
Potassium phosphate dibasic	Sigma	795496	For buffers (IB and RB)
Protease from Bacillus licheniformis	Sigma	P5459
Sodium chloride	Sigma	S9888	For buffer (CB)
Sodium pyruvate	Fisher bioreagents	BP356-100	Respirometry assays
Sucrose	Sigma	8510-OP	For buffer (IB)
Surgical dissection kit			Depends on animal and tissue source
Tabletop centrifuge			Must cool to 4 °C