Imágenes longitudinales in vivo de células de la retina con serotipos de virus adenoasociados personalizados mediante oftalmoscopia láser de barrido confocal

Resumen

Este protocolo describe el uso de vectores de virus adenoasociados (AAV) para el marcaje específico de células y la obtención de imágenes in vivo utilizando un oftalmoscopio láser de barrido confocal (CSLO). Este método permite la investigación de diferentes tipos de células de la retina y sus contribuciones a la función y la enfermedad de la retina.

Resumen

La naturaleza dinámica de los procesos celulares de la retina requiere avances en la administración de genes y las técnicas de monitoreo en vivo para mejorar la comprensión y el tratamiento de las enfermedades oculares. Este estudio presenta un enfoque optimizado de virus adenoasociados (AAV), utilizando serotipos y promotores específicos para lograr una eficiencia de transfección óptima en células de la retina específicas, incluidas las células ganglionares de la retina (RGC) y la glía de Müller. Aprovechando la precisión de la oftalmoscopia láser de barrido confocal (CSLO), este trabajo presenta un método no invasivo para la obtención de imágenes in vivo que captura la expresión longitudinal de la proteína verde fluorescente (GFP) mediada por AAV. Este enfoque elimina la necesidad de procedimientos terminales, preservando la continuidad de la observación y el bienestar del sujeto. Además, la señal de GFP se puede rastrear en las RGC infectadas por AAV a lo largo de la vía visual hasta el colículo superior (SC) y el núcleo geniculado lateral (LGN), lo que permite el potencial de mapeo directo de la vía visual. Estos hallazgos proporcionan un protocolo detallado y demuestran la aplicación de esta poderosa herramienta para estudios en tiempo real del comportamiento de las células de la retina, la patogénesis de la enfermedad y la eficacia de las intervenciones de terapia génica, ofreciendo información valiosa sobre la retina viva y sus conexiones.

Introducción

Al ser la única parte ópticamente accesible del sistema nervioso central, la retina sirve como un modelo valioso para la investigación en neurociencia^. Las células ganglionares de la retina (CGR), las neuronas de salida de la retina que transmiten información visual al cerebro, desempeñan un papel crucial en la función visual. Su pérdida o disfunción conduce a un deterioro de la visión y a una ceguera irreversible, como se observa en el glaucoma y otras neuropatías ópticas². La glía de Müller, las principales células gliales de la retina, son esenciales para mantener la homeostasis de la retina, proporcionar soporte estructural y metabólico a las neuronas, regular los niveles de neurotransmisores y contribuir a la reparación y regeneración de la retina³. Su disfunción está implicada en diversas enfermedades de la retina, como la retinopatía diabética⁴, la degeneración macular asociada a la edad⁵ y el síndrome isquémico ocular⁶. Las RGC y la glía de Müller exhiben interacciones cercanas e interdependencia; La glía de Müller proporciona un apoyo esencial a las CGR, mientras que la actividad de las RGC puede influir en la función de la glía de Müller ^3,7. El estudio de las RGC y de la glía de Müller es crucial para comprender la función de la retina y desarrollar tratamientos eficaces para múltiples enfermedades de la retina.

Las evaluaciones actuales en la investigación de la retina utilizan principalmente técnicas como la tomografía de coherencia óptica (OCT) para medir el grosor de la capa de fibras nerviosas de la retina o las trayectorias de los haces de axones ^8,9. Si bien estos métodos son invaluables para detectar la pérdida de RGC, no proporcionan una vista detallada de la morfología de RGC y las células gliales debido a la resolución limitada. Del mismo modo, aunque las técnicas avanzadas como la oftalmoscopia láser de barrido de óptica adaptativa (AO-SLO) permiten obtener imágenes a nivel celular de RGC, fotorreceptores y células gliales en la retina humana viva¹⁰, su complejidad técnica y su accesibilidad limitada limitan su uso principalmente a entornos de investigación especializados. Dadas estas limitaciones, existe la necesidad continua de desarrollar métodos más accesibles y fiables para el estudio en profundidad de poblaciones específicas de células de la retina in vivo.

En consecuencia, este protocolo tiene como objetivo introducir un enfoque de imagen alternativo adecuado para aplicaciones de investigación en células de la retina. Combina el poder del etiquetado específico del tipo de célula mediado por AAV con la naturaleza no invasiva de las imágenes CSLO. Los virus adenoasociados (AAV) son vectores versátiles de entrega de genes conocidos por su baja inmunogenicidad y su capacidad para transducir una amplia gama de tipos de células, incluidas las células en división y las que no se^{dividen 11}. Esto los convierte en herramientas ideales para dirigirse a poblaciones celulares específicas dentro del complejo entorno de la retina. Mediante el uso de vectores AAV con serotipos y promotores cuidadosamente seleccionados, se puede lograr la expresión selectiva de proteínas fluorescentes en múltiples tipos de células de interés, como las RGC y la glía de Müller. Por ejemplo, AAV2 es conocido por su mayor eficiencia de transducción en las RGC^12,13, mientras que AAV8 es marcadamente eficaz para dirigirse a los fotorreceptores¹⁴, y AAV9 demuestra fuertes capacidades de transfección en la glía de Müller¹⁵, mostrando una amplia eficiencia en varias capas de células de la retina. Es importante señalar que la eficacia de la AAV depende no solo de la elección del serotipo, sino también de los promotores, que dictan la intensidad y la especificidad celular de la expresión del transgén, lo que subraya la importancia de una selección cuidadosa para lograr una transducción óptima.

Para el etiquetado de RGC, este protocolo emplea AAV2 con el promotor de sinapsina humana (hSyn). AAV2 exhibe una transducción eficiente de RGCs después de la inyección intravítrea¹³, y el promotor hSyn, un promotor neuronal ubicuo, impulsa una expresión transgénica fuerte y específica dentro de estas células¹⁶. En el caso de la glía de Müller, el protocolo utiliza vectores AAV9 impulsados por el promotor¹⁷ de GfaABC1D, que demuestra una fuerte expresión de transgenes en estas células¹⁵. Este enfoque de etiquetado dirigido permite a los investigadores distinguir estas células del tejido retiniano circundante y rastrearlas a lo largo del tiempo, proporcionando una base para la vigilancia in vivo de las células de la retina y sus respuestas a los cambios bioambientales.

La oftalmoscopia láser de barrido confocal (CSLO) es una técnica de imagen no invasiva que proporciona imágenes de alta resolución de la retina viva, lo que permite la visualización en tiempo real de las poblaciones de células de la retina marcadas con fluorescencia 18,19,20. Un rayo láser enfocado escanea a través de la retina, capturando la luz emitida que pasa a través de un orificio para eliminar las señales desenfocadas, lo que da como resultado imágenes más nítidas con un contraste mejorado. Este protocolo utiliza un sistema Heidelberg Spectralis CSLO, que ha sido ampliamente utilizado para la obtención de imágenes de células de la retina en animales vivos, incluidos los estudios que visualizan las RGC ^21,22 y la microglía²³ marcadas con transgénicos. Mediante el empleo de la unidad HRA CSLO con un láser de 488 nm y los filtros adecuados, los investigadores pueden obtener imágenes de RGC marcadas con fluorescencia o glía de Müller en animales vivos después de la inyección intravítrea de vectores AAV portadores de genes reporteros fluorescentes. El protocolo de imágenes longitudinales, con sesiones semanales que cubren tanto la retina central como la periférica, realiza un seguimiento de los cambios a lo largo del tiempo. Para priorizar el bienestar animal, el protocolo utiliza el sistema automático de seguimiento ocular (ART) de la unidad HRA CSLO, lo que permite una adquisición precisa de imágenes sin necesidad de anestesia general o lentes de contacto.

Este protocolo aprovecha el poder combinado de AAV y CSLO para permitir el monitoreo longitudinal de tipos específicos de células de la retina in vivo. Al combinar la especificidad del tipo de célula del marcaje mediado por AAV con las capacidades de imágenes no invasivas y de alta resolución de CSLO, este método permite a los investigadores estudiar los cambios dinámicos en las RGC y la glía de Müller en respuesta a diversos estímulos o intervenciones. Estos conocimientos tienen un potencial significativo para informar el desarrollo de nuevas estrategias diagnósticas y terapéuticas para las enfermedades de la retina.

Protocolo

Todos los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con la Declaración de ARVO para el Uso de Animales en la Investigación Oftálmica y de la Visión y fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Médica de la Capital, Beijing. Para todos los experimentos se utilizaron ratones machos C57BL/6J adultos de cuatro semanas de edad (con un peso de entre 15 y 20 g) y se alojaron en salas con temperatura controlada con un ciclo de luz/oscuridad de 12/12 horas. La comida estándar para roedores y el agua estaban disponibles ad libitum. Los detalles de los reactivos y equipos utilizados en este estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Transfección de células retinianas mediada por AAV

NOTA: Para la transducción dirigida de RGC, este protocolo utiliza AAV2-hSyn-eGFP, que incorpora el promotor hSyn para impulsar una expresión robusta de GFP mejorada. La glía de Müller se ataca con AAV9-GfaABC1D-eGFP. Para lograr una eficiencia de transducción óptima y una expresión transgénica robusta, se recomienda un título mínimo de AAV de 1 x^{10 12} genomas virales (vg)/mL para las inyecciones intravítreas en ratones¹³.

1. Cumpla con estrictos protocolos de seguridad al realizar procedimientos de transfección de células de la retina mediados por AAV para evitar la exposición accidental y garantizar un entorno de trabajo seguro.
2. Realizar todos los procedimientos que involucren vectores virales dentro de un gabinete de bioseguridad (BSC) certificado. Equipar al personal con el equipo de protección personal (EPP) adecuado, incluyendo batas de laboratorio, guantes y protección para los ojos, durante todo el procedimiento.
3. Deseche todos los objetos punzocortantes y materiales de riesgo biológico de manera adecuada de acuerdo con los protocolos de seguridad institucionales para mantener el cumplimiento y salvaguardar a todo el personal del laboratorio.

2. Preparación de vectores virales y animales

1. Obtenga los vectores AAV2-hSyn-eGFP o AAV9-GfaABC1D-eGFP almacenados a -80 °C. Descongele los vectores en hielo inmediatamente antes de usarlos para preservar la integridad viral.
2. Anestesiar a los ratones con una inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico a una dosis de 50 mg/kg. Confirme la profundidad de la anestesia probando los reflejos del pie trasero antes de realizar más acciones.
3. Recorte los bigotes para evitar interferencias con el área quirúrgica durante el procedimiento. Desinfecte la órbita con una solución de povidona yodada al 20% durante 2 s, luego enjuague abundantemente con solución salina normal estéril.
4. Aplique una gota de proparacaína al 0,5% por vía tópica para minimizar las molestias y evitar movimientos oculares involuntarios.

3. Manipulación e inyección intravítrea de vectores virales

1. Transfiera 1 μL de la solución de AAV seleccionada (ya sea AAV2-hSyn-eGFP o AAV9-GfaABC1D-eGFP) a un trozo de película de parafina limpia y preenfriada para evitar fluctuaciones de temperatura que puedan afectar la actividad viral.
2. Aspire la solución de AAV con una jeringa de vidrio Hamilton con una aguja biselada de 33 G bajo el microscopio quirúrgico oftálmico.
3. Coloque el ratón en decúbito ventral bajo el microscopio. Incline ligeramente la cabeza para elevar el lado ocular destinado a la inyección. Ajuste y optimice el aumento del microscopio para identificar claramente la región superior de la órbita del ratón.
4. Inserte la aguja 1-2 mm detrás del limbo en el margen escleral superior del ojo en la cavidad vítrea. Inyecte las soluciones de AAV lentamente para evitar el reflujo o el daño inducido por la presión.
   NOTA: Ubicación del lugar de la inyección: Realice la inyección en el cuadrante temporal superior del ojo, aproximadamente 1 mm posterior al limbo. Elija esta ubicación para evitar los vasos sanguíneos principales y minimizar el riesgo de dañar el cristalino. Evite los sitios de inyección demasiado cerca del limbo para evitar la penetración del iris o la abrasión del cristalino. Evitar la vasculatura: Use un microscopio quirúrgico para examinar cuidadosamente el sitio de inyección planificado en busca de vasos sanguíneos visibles antes de la inyección. Si hay embarcaciones presentes, ajuste ligeramente el punto de entrada para evitarlas. Inserte la aguja en un ángulo poco profundo, paralelo al iris, para reducir aún más el riesgo de daño vascular. Evite las inyecciones repetidas en la misma área para reducir el riesgo de hemorragia subretiniana.
5. Mantenga la aguja en su lugar durante 30 segundos para permitir que los vectores se dispersen dentro de la cámara vítrea y se asienten en la superficie de la retina, maximizando así las posibilidades de una transducción exitosa.
6. Retire la aguja lentamente para minimizar el riesgo de reflujo vítreo.
7. Aplique un ungüento antibiótico tópico en el lugar de la inyección inmediatamente después de la inyección. Asegúrese de que el ungüento se aplique de manera uniforme para cubrir completamente la superficie ocular, evitando la infección ocular y la inflamación.
   NOTA: La pomada antibiótica contiene 1 mg/g de dexametasona, 3500 UI/g de sulfato de neomicina y 6000 UI/g de sulfato de polimixina B.
8. Coloque el mouse sobre una almohadilla térmica para mantener la temperatura corporal durante la recuperación de la anestesia y vigílelos de cerca para detectar cualquier signo de angustia o anomalías. Una vez que estén completamente recuperados y no presenten complicaciones, devuélvalos a sus jaulas con acceso a comida y agua normales.

4. Imágenes in vivo con CSLO

1. Preparación animal
   1. Seleccione el ratón infectado con AAV2-hSyn-eGFP o AAV9-GfaABC1D-eGFP después de 4 semanas de inyección intravítrea. Aplique una gota de una solución oftálmica que contenga 0,5% de tropicamida y 0,5% de fenilefrina en la superficie del ojo para dilatar la pupila hasta aproximadamente 2 mm de diámetro²².
      NOTA: Se recomienda un mínimo de 4 semanas de intervalo de tiempo de transducción de AAV para el marcaje fluorescente óptimo de las células de la retina después de la inyección^{intravítrea 13}. Además, en nuestros experimentos de aplastamiento del nervio óptico (ONC), se tomaron imágenes de las retinas a las 4 semanas después de la infección, así como a los días 7 y 14 después de la lesión por aplastamiento. Estos puntos de tiempo se eligieron para capturar tanto la expresión inicial de AAV como la progresión de los cambios en la retina después de la ONC.
   2. Cubra la plataforma de imágenes con un trozo de la almohadilla limpia para evitar la posible contaminación de los excrementos de los animales durante el proceso de operación.
      NOTA: La plataforma de imágenes personalizada proporciona un amplio espacio para que el animal se acueste boca abajo, lo que garantiza la estabilidad y minimiza el movimiento durante la sujeción manual para una adquisición óptima de la imagen.
   3. Transfiera con cuidado el ratón a la plataforma de imágenes y permita un período de aclimatación de 2 a 5 minutos antes de la obtención de imágenes para minimizar el estrés y facilitar la adaptación al entorno de imágenes.
   4. Con la ayuda de un segundo técnico, sujete suavemente al animal mientras mantiene un estado consciente durante todo el procedimiento. Proporcione un intervalo de descanso de 10 segundos después de 15 segundos de imágenes para permitir el parpadeo y mantener la humedad de la córnea.
      NOTA: Frote suavemente la piel del cuero cabelludo para inducir el levantamiento espontáneo de los párpados, evitando el uso de inmovilización forzada de los párpados o dispositivos adicionales como pinzas, reduciendo así el riesgo de lesiones oculares. La anestesia general no se emplea para preservar la claridad óptica durante sesiones de imágenes prolongadas, ya que tiene el potencial de exacerbar la opacidad transitoria del cristalino. Equilibre la adquisición de imágenes de alta calidad con la comodidad y seguridad de los animales durante todo el procedimiento. Complete todo el procedimiento en 5 minutos para garantizar el bienestar del animal y mantener la calidad de las imágenes.
   5. Ajuste la postura de la cabeza y alinee la lente de la cámara ajustando la perilla de enfoque (Figura 1B) y el micromanipulador (Figura 1C) para apuntar a la región de interés (ROI) para la posterior obtención de imágenes in vivo .
2. Configuración del sistema
   1. Coloque una lente gran angular de 55° sin contacto en la cámara para ampliar el campo de visión del área del fondo de ojo.
   2. Coloque la rueda de filtros en la posición A (angiografía) para permitir la adquisición del modo de imágenes de angiografía infrarroja (IR) y fluorescente (FA) (Figura 1A). Encienda el láser y la fuente de alimentación para activar el sistema de imágenes CSLO.
   3. Abra el software Heidelberg Eye Explorer y cree un nuevo examen haciendo clic en el icono Nuevo paciente en la parte superior de la barra de menú. Introduzca la información relevante del animal y acepte la curvatura corneal predeterminada de 7,7 mm en la ventana emergente.
   4. Seleccione el botón amarillo de inicio (Figura 1E) en la pantalla del panel de control para iniciar el modo de imagen en vivo.
3. Imágenes CSLO in vivo
   1. Seleccione el modo IR (Figura 1G) con autofluorescencia a una longitud de onda de excitación de 820 nm en el panel de control. Para lograr imágenes de alta resolución, el High Res. El modo (HR) se activa a través de la interfaz de ventana o del panel de control manual (Figura 1F).
      NOTA: Las imágenes de reflectancia infrarroja (IR) suelen ser el primer paso en las imágenes oftálmicas CLSO, adquiridas antes de la angiografía con fluoresceína (FA), para proporcionar una vista de referencia. Incluso la iluminación, los artefactos mínimos y el enfoque nítido en los principales vasos de la retina son cruciales para la fiabilidad del enfoque en el plano z y el logro de imágenes IR de alta calidad.
   2. Mueva la lente hacia el ojo del ratón utilizando el joystick con el micromanipulador XYZ para un ajuste fino. Examine la transparencia óptica y gire la perilla de sensibilidad (Figura 1D) en sentido contrario a las agujas del reloj para disminuir el brillo de la imagen del fondo de ojo al 40%-60%, evitando así la sobreexposición del fondo de ojo y mejorando la visualización de los detalles de la retina.
   3. Ajuste la perilla de enfoque y el micromanipulador hasta que el disco óptico y los vasos de la retina se identifiquen sin ambigüedad en el fondo de ojo.
      NOTA: Criterios del plano focal óptimo: (1) Vista del fondo de ojo uniformemente iluminada sin esquinas oscuras. (2) Iluminación uniforme que rodea el disco óptico sin puntos oscuros focales ni distorsión. (3) Forma clara de la luz de los grandes vasos de la retina con el movimiento visible del flujo sanguíneo.
   4. Cambie al modo FA (Figura 1H) con un láser azul de estado sólido a una longitud de onda de excitación de 488 nm y un filtro de barrera a 500 nm. Gire la perilla de sensibilidad (Figura 1D) en el sentido de las agujas del reloj para aumentar el brillo de la imagen del fondo de ojo a 50%-107% para iluminar el área de la retina objetivo.
   5. Establezca el valor medio de ART (una barra azul en la parte inferior izquierda de la interfaz del software) en al menos 15 para mejorar la relación señal-ruido. Esta función promedia una serie de B-scans adquiridos en la misma ubicación, lo que mejora la calidad de la imagen.
      NOTA: Si bien un valor promedio de ART más alto generalmente mejora la calidad de la imagen a través del promedio, también extiende la duración del escaneo. Esta duración prolongada podría aumentar el riesgo de deshidratación de la córnea y fatiga de los animales, factores que deben considerarse cuidadosamente, especialmente en las imágenes de animales despiertos.
   6. Se realinean con el plano interno de la retina, dirigiéndose específicamente a las RGC que expresan GFP o a las células gliales de Müller. Se realizan ajustes finos para garantizar una iluminación nítida de la población celular deseada, como el soma y los axones de RGC, o el cuerpo de la célula de Müller. La sensibilidad de la imagen se equilibra para lograr una visualización óptima y evitar la sobresaturación de las células GFP positivas.
      NOTA: Para obtener las imágenes con una claridad y brillo comparables a los de la señal GFP, la adquisición de sensibilidad debe ser constante para todos los ratones del experimento.
   7. Presione la perilla de sensibilidad (Figura 1D) para iniciar el modo ART, que genera una imagen media en vivo en línea. Espere hasta que la barra azul (que representa el valor medio de ART) en la parte inferior izquierda de la interfaz del software haya alcanzado el valor de ART establecido (≥ 20 fotogramas) y toque el botón Adquirir en la interfaz de control para capturar las imágenes del fondo de ojo.
      NOTA: Para el modo ART, el seguimiento ocular está incorporado para compensar automáticamente los movimientos oculares menores durante la obtención de imágenes in vivo , lo que permite un enfoque consistente en el plano focal de la retina seleccionado.
   8. Una vez adquiridas las imágenes deseadas, salga del modo ART pulsando el mando de sensibilidad del panel táctil.
      NOTA: Para evitar la desecación de la córnea y permitir el parpadeo espontáneo, se implementaron descansos de 10 s cada 15 s durante el proceso de imagen.
   9. Para navegar por las áreas nasales y temporales de la retina, mueva el cabezal de la cámara horizontalmente mientras observa la imagen en vivo en la pantalla. Una vez alcanzada la región objetivo, ajuste el enfoque e inicie el proceso de obtención de imágenes como se describe en los pasos 2.3.1-2.3.8.
      NOTA: Mantenga los movimientos lentos y controlados de la cámara mientras garantiza una iluminación consistente y brillante del fondo de ojo. Si aparecen áreas oscuras, utilice el micromanipulador para ajustar la posición de la cámara verticalmente y volver a centrar la retina.
   10. Para obtener una imagen de la retina superior, ajuste suavemente la postura de la cabeza del ratón a una posición boca arriba. Incline moderadamente la cabeza de la cámara hacia arriba para alinearla con la región superior de la retina. Vuelva a ajustar el enfoque según sea necesario y proceda con la obtención de imágenes.
   11. Una vez finalizadas las imágenes, todas las regiones de la retina deseadas salen de la ventana de adquisición y las imágenes se guardan automáticamente. Aplique lubricante tópico en el ojo del que se obtiene la imagen para mantener la hidratación de la córnea.
   12. Para iniciar el examen del ojo contralateral, vuelva a colocar al animal en el lado opuesto de la plataforma y repita los pasos 2.3.1-2.3.11.

5. Procesamiento y análisis de imágenes

1. Exportación y preparación de imágenes
   1. Abra el software Heidelberg Eye Explorer y seleccione la sesión de imágenes CSLO deseada con buena calidad. Elija imágenes únicas o consecutivas de la misma ubicación de la retina con ajustes de sensibilidad consistentes a lo largo del tiempo.
   2. Excluya las imágenes borrosas con poco enfoque o claridad corneal, asegurándose de que solo se utilicen para el análisis imágenes con una visualización clara de las estructuras de la retina. Exporte estas imágenes en formato TIFF para su posterior procesamiento.
2. Alineación y recorte de imágenes
   1. Agrupe las imágenes por ojo de ratón en función de la misma región de la retina.
      NOTA: Las imágenes originales adquiridas del sistema CSLO se guardan en el siguiente formato: TIFF, con una dimensión de 1536 x 1536 píxeles, una resolución de 5,69 mmm/píxel y un valor ART de ≥15.
   2. Para los exámenes de seguimiento, importe las imágenes en un software de procesamiento de imágenes adecuado. Gire y alinee las imágenes según sea necesario para que coincidan con la orientación de la imagen de referencia. Al guardar o exportar las imágenes procesadas, utilice ajustes que mantengan la calidad de imagen más alta posible para minimizar los posibles artefactos de compresión.
   3. Alinee las imágenes CSLO de una serie temporal del mismo ojo girándolas para que coincidan con la imagen de referencia respectiva utilizando la vasculatura y el disco óptico como puntos de referencia.
      NOTA: Examine cuidadosamente cada imagen alineada y, antes de proceder a recortarla, asegúrese de que cumplan con los siguientes criterios: (1) Captura completa de la región retiniana: la imagen debe abarcar completamente la región retiniana de interés prevista, incluidos los puntos de referencia clave como el disco óptico y los vasos sanguíneos principales; (2) Ausencia de artefactos de movimiento: La imagen debe estar libre de desenfoque, rayas o duplicación de estructuras causadas por el movimiento de los ojos durante la toma de imágenes; (3) Distorsión mínima: La imagen debe representar con precisión la estructura de la retina sin artefactos de deformación, estiramiento o compresión que podrían surgir de los ángulos de la imagen o los efectos de la lente. (4) Equilibrio de las métricas de calidad de imagen: evaluaciones de los niveles de ruido de fondo (desviación estándar de las intensidades de píxeles en áreas sin estructura < 5 (escala 0-255)); relación señal-ruido (SNR >20), consistencia de la iluminación (coeficiente de variación entre seis cuadrantes de imagen <10%) y uniformidad de la imagen (coeficiente de variación en regiones homogéneas <15%).
   4. Seleccione la imagen girada y expórtela en formato TIFF. Para cada punto de tiempo, utilice la herramienta de recorte para seleccionar y recortar aleatoriamente de 5 a 10 áreas (de 300 x 300 píxeles cada una) que contengan celdas positivas para GFP de las imágenes de calidad aprobada. Exporte cada imagen recortada individualmente en formato TIFF para su posterior análisis.
3. Medición de la intensidad de fluorescencia
   1. Abra las imágenes CSLO recortadas (escala de grises de 8 bits, 300 x 300 píxeles) en ImageJ/Fiji.
   2. Para examinar los cambios generales en las señales fluorescentes, mida la intensidad de fluorescencia total por imagen recortada utilizando Analizar > medir (o Ctrl + M). Registre el valor "Medio", que representa la intensidad media de fluorescencia GFP de toda la imagen recortada.
4. Cuantificación de RGC
   1. En ImageJ/Fiji, ajuste el umbral de intensidad de las imágenes CSLO recortadas utilizando Imagen > Ajustar > Brillo/Contraste para lograr una visualización óptima de los cuerpos individuales de soma blanco sobre el fondo negro.
      NOTA: Determine un umbral individualizado después de revisar el lote de imágenes recortadas, o aplique un algoritmo de umbral coherente (por ejemplo, el método⁵ de Huang en ImageJ/Fiji). Para el método de Huang: (1) Convertir imágenes a escala de grises de 8 bits (Tipo de imagen > > 8 bits). (2) Acceda a la herramienta de umbrales (Imagen > Ajustar > umbral). (3) Seleccione Huang como método de umbral. (4) Obtenga una vista previa de la segmentación y haga clic en Aplicar. El umbral se calculará automáticamente y se mostrará en el histograma de la imagen.
   2. Active el complemento Cell Counter y haga clic en cada soma RGC positivo para GFP para contar. Registre el número total de celdas marcadas en la región analizada. Repita este proceso para todas las imágenes recortadas de cada punto de tiempo de seguimiento.
5. Análisis de datos
   1. Exporte los datos de recuento de células e intensidad de fluorescencia a una hoja de cálculo o software estadístico (por ejemplo, GraphPad Prism).
   2. Realizar las pruebas estadísticas adecuadas con base en el diseño experimental y las hipótesis correspondientes. Interpreta los resultados y concluye.

Resultados

Siguiendo el protocolo presentado, se visualizaron y rastrearon con éxito diferentes células de la retina in vivo utilizando una combinación de entrega de genes mediada por AAV y CSLO. AAV2-hSyn-eGFP transdució eficazmente las RGC, lo que dio lugar a una expresión robusta de eGFP en toda la retina, como lo confirmó CSLO y la colocalización con el marcador específico de RGC, la proteína de unión al ARN con empalme múltiple (RBPMS), que se encuentra específicamente en ...

Discusión

El protocolo presentado detalla un método robusto y accesible para la vigilancia in vivo de poblaciones específicas de células de la retina, aprovechando el poder de la entrega de genes mediada por AAV y las imágenes de CSLO. Este enfoque ofrece varias ventajas sobre los métodos tradicionales, ya que facilita los estudios longitudinales de la dinámica de las células de la retina y sus respuestas a lesiones o enfermedades en condiciones fisiológicas o patológicas.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
33 Gauge Needle	Hamilton Corp., Reno, NV, USA	7803-05	For intravitreal injection
0.5% proparacaine	Santen Pharmaceutical Co., Ltd.		Topical Aneasthetics
AAV2-hSyn-eGFP	OBiO Technology Corp., China		Virus titer: 2.7 x 1012 viral genomes (vg)/mL
AAV9-GfaABC1D-eGFP	WZ Biosciences Inc., China		Virus titer: 4.5 x 1012 viral genomes (vg)/mL
Betadine	Healthy medical company	001651	Topical Antiseptics
Corneal scelar forceps (toothed)	Mingren Eye Instruments, China	MR-F301A	For eyelid secure during intravitreal injection
Dumont 05# forceps	FST	51-AGT5385	For optic nerve crush
Graphpad prism	GraphPad Prism, USA		Graph drawing and statistical analysis
HRA Spectralis	Heidelberg Engineering, GmbH, Dossenheim, Germany		"IR" and "FA" mode for CSLO imaging
Image J/Fiji	National Institutes of Health, USA		Image processing
Maxitrol antibiotic ointment	Alcon Laboratories, INC. USA	0065-0631	Topical antibiotics
Microliter Syringe	Hamilton Corp., Reno, NV, USA	7633-01	For intravitreal injection
Mydrin-P Ophthalmic solution	Santen Pharmaceutical Co.,Ltd, Japan		Pupil dilation
Ophthalmic surgical microscope	Leica AG, Heerbrugg, Switzerland	M220	For surgical operations
Pentorbarbitol Sodium	Sigma Aldrich, USA	57-33-0	Genereal Aneasthetics
Powerpoint	Microsoft Corporation, USA		Image alignment and cropping
VISCOTEARS Liquid Gel (Carbomer)	Dr. Gerhard Mann, Chem.-Pharm. Fabrik, Germany		Topical lubricant