Desarrollo y aplicación de tirosina fosfatasas reguladas por rapamicina

Resumen

Este protocolo describe el diseño, la creación y la aplicación de las fosfatasas reguladas por rapamicina. Este método proporciona una alta especificidad y un estricto control temporal de la activación de la fosfatasa en las células vivas.

Resumen

Las tirosina fosfatasas son una familia importante de enzimas que regulan funciones fisiológicas críticas. A menudo están desregulados en las enfermedades humanas, lo que los convierte en objetivos clave de los estudios biológicos. Las herramientas que permiten la regulación de la actividad de la fosfatasa son fundamentales en la disección de su función. Los enfoques tradicionales, como la sobreexpresión de mutantes negativos constitutivamente activos o dominantes, o la regulación negativa mediante siRNA, carecen de control temporal. Los inhibidores de la fosfatasa a menudo tienen poca especificidad y solo permiten a los investigadores determinar qué procesos se ven afectados por la inhibición de la fosfatasa.

Desarrollamos un enfoque quimiogenético, el sistema regulado por rapamicina (RapR), que permite la regulación alostérica de un dominio catalítico de fosfatasa que permite un control temporal estricto de la activación de la fosfatasa. El sistema RapR consiste en un dominio iFKBP insertado en un sitio alostérico en la fosfatasa. La dinámica estructural intrínseca del dominio RapR interrumpe el dominio catalítico, lo que lleva a la inactivación de la enzima. La adición de rapamicina media la formación de un complejo entre iFKBP y una proteína FRB coexpresada, que estabiliza la iFKBP y restaura la actividad del dominio catalítico de la fosfatasa.

Este sistema proporciona una alta especificidad y un estricto control temporal de la activación de la fosfatasa en las células vivas. Las capacidades únicas de este sistema permiten la identificación de eventos transitorios y la interrogación de vías de señalización individuales aguas abajo de una fosfatasa. Este protocolo describe las pautas para el desarrollo de una RapR-fosfatasa, su caracterización bioquímica y el análisis de sus efectos sobre la señalización y regulación posteriores de la morfodinámica celular. También proporciona una descripción detallada de una estrategia de ingeniería de proteínas, ensayos in vitro que analizan la actividad de la fosfatasa y experimentos de imágenes de células vivas que identifican cambios en la morfología celular.

Introducción

Las proteínas tirosina fosfatasas son una familia crítica de proteínas involucradas en una gran cantidad de eventos de señalización celular. Se ha demostrado que desempeñan un papel clave en la regulación de la proliferación, migración y apoptosis celular ^1,2,3. En consecuencia, la desregulación de la proteína tirosina fosfatasas conduce a una variedad de enfermedades y trastornos debilitantes 4,5,6,7. El estudio de....

Protocolo

1. Diseño de RapR-fosfatasas

1. Planificación
   NOTA: Usando RapR-Shp2 como ejemplo, este protocolo detalla los pasos importantes para crear una tirosina fosfatasa regulada por rapamicina. El protocolo descrito está optimizado para Shp2 y es posible que se necesiten modificaciones adicionales para adaptarse a las propiedades específicas de las fosfatasas individuales.
   1. Para asegurar que la actividad catalítica de Shp2 esté puramente controlada por la rapamicina y no por mecanismos endógenos, introduzca una mutación en la fosfatasa para mantenerla en una conformación constitutivamente activa. En el caso d....

Discusión

Este protocolo proporciona pasos detallados para el desarrollo, la caracterización y la aplicación de fosfatasas controladas quimiogenéticamente. La herramienta RapR-Shp2 se basa en un interruptor regulado por rapamicina insertado en el dominio catalítico Shp2. El punto fuerte de esta herramienta es la especificidad y el estricto control temporal de la actividad de la fosfatasa. La herramienta es aplicable a otras fosfatasas y, en combinación con la tecnología RapR-TAP descrita ant.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
#1.5 Glass Coverslips 25 mm Round	Warner Instruments	64-0715
1.5 mL Tubes	USA Scientific	cc7682-3394
2x Laemmli Buffer			For 500 mL: 5.18 g Tris-HCL, 131.5 mL glycerol, 52.5 mL 20% SDS, 0.5 g bromophenol blue, final pH 6.8
4-20% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel	Biorad	4561096
5x Phusion Plus Buffer	Thermo Scientific	F538L
A431 Cells	ATCC	CRL-1555
Agarsose	GoldBiotech	A-201
Attofluor Cell Chamber	invitrogen	A7816
Benchmark Fetal Bovine Serum (FBS)	Gemini Bio-products	100-106	Heat Inactivated Triple 0.1 µm sterile-filtered
Brig 35,30 w/v %	Acros	329581000
BSA	GoldBiotech	A-420
CellGeo	N/A	N/A	Published in 10.1083/jcb.201306067
CellMask Deep Red plasma membrane dye	invitrogen	c10046
Colony Screen MasterMix	Genesee	42-138
DH5a competent cells	NEB	C2987H
DMEM	Corning	15-013-CV
DMSO	Thermo Scientific	F-515
DNA Ladder	GoldBio	D010-500
dNTPs	NEB	N04475
DpnI Enzyme	NEB	R01765
DTT	GoldBio	DTT10	DL-Dithiothreitol, Cleland's Reagents
EGTA	Acros	409910250
Fibronectin from bovine plasma	Sigma	F1141
FuGENE(R) 6 Transfection Reagent	Promega	E2692	transfection reagent
Gel extraction Kit	Thermo Scientific	K0692	GeneJET Gel Extraction Kit
Gel Green Nucleic Acid Stain	GoldBio	G-740-500
Gel Loading Dye Purple 6x	NEB	B7024A
Glutamax	Gibco	35050-061	GlutaMAX-l (100x) 100 mL
HEK 293T Cells	ATCC	CRL-11268
HeLa Cells	ATCC	CRM-CCL-2
HEPES	Fischer	BP310-500
ImageJ Processing Software	N/A	N/A
Igepal CA-630 (NP40)	Sigma	I3021
Imidazole Buffer			25 mM Imidazole pH 7.2, 2.5 mM EDTA, 50 mM NaCl, 5 mM DTT
KCl	Sigma	P-4504
L-15 1x	Corning	10-045-CV
LB Agar	Fisher	BP1425-2
Lysis Buffer			20 mM Hepes-KOH, pH 7.8, 50 mM KCl, 1 mM EGTA, 1% NP40
MATLAB	MathWorks	N/A	R 2022b update was used to run CellGeo functions
Metamorph Microscopy Automation and Image Analysis Software	N/A	N/A
MgCl2	Fisher Chemical	M33-500
Mineral Oil	Sigma	M5310
MiniPrep Kit	Gene Choice	96-308
Mini-PROTEAN TGX Precast Gels 12 well	Bio-Rad	4561085
Molecular Biology Grade Water	Corning	46-000-CV
Multiband Polychroic Mirror	Chroma Technology	89903BS
NaCl	Fisher Chemical	S271-3
Olympus UPlanSAPO 40x objective	Olympus	N/A
PBS w/o Ca and Mg	Corning	21-031-CV
PCR Tubes	labForce	1149Z65	0.2 mL 8-Strip Tubes and Caps, Rigid Strip Individually Attached Dome Caps
Phusion Plus DNA Polymerase	Thermo Scientific	F630S
Primers	IDT
Protein-G Sepharose	Millipore	16-266
PVDF Membranes	BioRad	1620219	Immun-Blot PVDF/Filter Paper Sandwiches
Rapamycin	Fisher	AAJ62473MF
0.25% Trypsin, 2.21 mM EDTA, 1x [-] sodium	Corning	25-053-CI
Tris-Acetate-EDTA (TAE) 50x	Fischer	BP1332-1	for electrophoresis
Wash Buffer			20 mM Hepes-KOH, pH 7.8, 50 mM KCl, 100 mM NaCl, 1 mM EGTA, 1% NP40
β-Mercaptoethanol	Fisher Chemical	O3446I-100
Antibodies
Anti-EGFR Antibody	Cell Signaling	2232
Anti-Erk 1/2 Antibody	Cell Signaling	9102
Anti-Flag Antibody	Millipore-Sigma	F3165
Anti-GAPDH Antibody	invitrogen	AM4300
Anti-GFP Antibody	Clontech	632380
Anti-mCherry Antibody	invitrogen	M11217
Anti-paxillin Antibody	Thermo Fischer	BDB612405
Anti-phospho-EGFR Y992 Antibody	Cell Signaling	2235
Anti-phospho-Erk 1/2 T202/Y204 Antibody	Cell Signaling	9101
Anti-phospho-paxillin Y31 Antibody	Millipore-Sigma	05-1143
Anti-phospho-PLCγ Y783 Antibody	Cell Signaling	14008
Anti-PLCγ Antibody	Cell Signaling	5690