Estandarización de un novedoso software semiautomático para la medición del crecimiento de neuritas

Resumen

Los ensayos de excrecencia de neuritas proporcionan un valor cuantitativo sobre los procesos neuronales regenerativos. La ventaja de este software semiautomático es que segmenta los cuerpos celulares y las neuritas por separado mediante la creación de una máscara y mide varios parámetros, como la longitud de las neuritas, el número de puntos de ramificación, el área del grupo de cuerpos celulares y el número de grupos celulares.

Resumen

Las técnicas efectivas de imagen en vivo son cruciales para evaluar la morfología neuronal con el fin de medir el crecimiento de neuritas en tiempo real. La medición adecuada del crecimiento de neuritas ha sido un desafío de larga data a lo largo de los años en el campo de la investigación en neurociencia. Este parámetro sirve como piedra angular en numerosas configuraciones experimentales in vitro , que van desde cultivos disociados y cultivos organotípicos hasta líneas celulares. Al cuantificar la longitud de la neurita, es posible determinar si un tratamiento específico funcionó o si se potencia la regeneración axonal en diferentes grupos experimentales. En este estudio, el objetivo es demostrar la robustez y precisión del software de análisis de crecimiento de neuritas Incucyte Neurotrack. Este software semiautomático está disponible en un sistema de microscopía de lapso de tiempo que ofrece varias ventajas sobre las metodologías comúnmente utilizadas en la cuantificación de la longitud de la neurita en imágenes de contraste de fase. El algoritmo enmascara y cuantifica varios parámetros en cada imagen y devuelve métricas de células neuronales, incluida la longitud de las neuritas, los puntos de ramificación, los grupos de cuerpos celulares y las áreas de grupos de cuerpos celulares. En primer lugar, validamos la robustez y precisión del software correlacionando sus valores con los del manual NeuronJ, un plug-in de Fiji. En segundo lugar, utilizamos el algoritmo que es capaz de trabajar tanto en imágenes de contraste de fase como en imágenes de inmunocitoquímica. Utilizando marcadores neuronales específicos, validamos la viabilidad del análisis de crecimiento de neuritas basado en fluorescencia en neuronas sensoriales en cultivos in vitro . Además, este software puede medir la longitud de las neuritas en diversas condiciones de siembra, que van desde células individuales hasta redes neuronales complejas. En conclusión, el software proporciona una plataforma innovadora y eficaz en el tiempo para los ensayos de crecimiento de neuritas, allanando el camino para cuantificaciones más rápidas y fiables.

Introducción

En los nervios ciáticos, es posible medir la regeneración axonal¹. Además, estudios in vitro han demostrado la viabilidad de monitorizar el crecimiento axonal ^2,3 para comprender sus diversas fases, desde la brotación axonal hasta la degeneración axonal, tanto en neuronas sanas como lesionadas. Mediante el seguimiento de estos procesos, es posible medir parámetros como la polaridad axonal, la iniciación, la estabilidad y la ramificación. Este último parámetro es crucial para entender la percepción del dolor neuropático <....

Protocolo

1. Escaneo del recipiente en la máquina

NOTA: La detección se realiza mediante la cámara Basler Ace 1920-155 μm incorporada.

1. Abra el programa haciendo clic en Conectar al dispositivo y seleccionando Programar - Adquirir. A continuación, haga clic en el signo + .
2. Especifique si el buque se escaneará repetidamente o solo 1 vez eligiendo la opción Escanear a tiempo o Escanear una vez ahora, respectivamente.
3. Seleccione Nuevo para crear un recipiente completamente n....

Discusión

Medir con precisión cómo crecen las neuronas en condiciones sanas, lesionadas y enfermas es un parámetro crítico en muchas configuraciones experimentales dentro del campo de la neurociencia. Ya sea que se trabaje con cultivos organotípicos de explantes enteros de DRG o cultivos disociados, la medición adecuada del crecimiento axonal ha sido un desafío importante en los últimos 20 años. Sin una cuantificación fiable y precisa del crecimiento de neuritas, es imposible evaluar si .......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Collagenase A	Merck / Roche	10103586001
Dispase II (neutral protease, grade II)	Merck / Roche	4942078001
Dulbecco's modified eagle's medium	Merck / Sigma	D5796
Fetal bovin serum	Merck / Sigma	F7524
Ham's F-12 Nutrient Mix (1X)	ThermoFisher Scientific	21765029
Ham's F12 w/ L-Glutamine	Euroclone	ECM0135L
Hanks' Balanced Salt Solution	Euroclone	ECM0507L
HBSS (10X), no calcium, no magnesium, no phenol red	ThermoFisher Scientific	14185045
HyClone Characterized Fetal Bovine Serum (U.S.)	Cytiva	SH30071.03
Incucyte, Neurotrack Analysis Software	Sartorius	9600-0010
L-15 Medium (Leibovitz)	Millipore/Sigma	L5520
Laminin Mouse Protein, Natural	ThermoFisher Scientific	23017015
L-Cysteine	Merck / Sigma	C7352
Leibovitz's L-15 medium w/o L-glutamine	Euroclone	ECB0020L
mouse NGF 2.5S (>95%)	Alomone Labs	N-100
Neurobasal Medium [-] Glutamine	ThermoFisher Scientific	21103049
NSC-34	CELLutions Biosystems Inc (Ontario, Canada)	CLU140
Papain from papaya latex	Sigma	P4762
Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL)	ThermoFisher Scientific	15070063
Percoll (Density 1.130 g/mL)	Cytiva	17089101
Poly-D-Lysine Solution (1mg/mL)	EMD Millipore/Merck	A-003-E
Poly-L-Lysine Solution (0-01%)	Sigma	P4832
Recombinant Human NT-3	PeproTech	450-03
Retinoic Acid	Merck / Sigma	R2625
Trypsin-EDTA solution	Sigma	T3924
β-Tubulin III (Tuj1) antibody	Merck / Sigma	T8660