Técnica optimizada y simplificada para la producción y el cultivo de láminas de hígado cortadas con precisión

Resumen

Un protocolo para la producción y el cultivo de rodajas de hígado cortadas con precisión (PCLS) para el estudio de hígados de ratón. El artículo se centra en aspectos clave del protocolo, que solo requiere un equipo de laboratorio estándar con acceso a un vibratomo y permite la supervivencia del PCLS durante un mínimo de 4 días.

Resumen

Este protocolo presenta un sistema sencillo para la creación y el cultivo de rodajas de hígado cortadas con precisión (PCLS). El PCLS contiene todas las células en un entorno intacto y, por lo tanto, se asemeja a un mini modelo de todo el órgano. Permiten el estudio de tejidos vivos mientras replican sus fenotipos complejos. Este protocolo permite la preparación de lonchas de hígado de ratón utilizando un vibratomo y equipo de laboratorio estándar. Los protocolos para producir y cultivar PCLS carecen de estandarización y pueden variar drásticamente según el tejido de interés, el tipo de vibratomo utilizado y la necesidad de oxígeno. Estos pueden ser difíciles de reproducir en algunos laboratorios que solo tienen acceso a un vibratomo básico e instalaciones comunes de cultivo de tejidos. Hemos elaborado un protocolo que se centra en la importancia de algunos pasos clave dentro de los diversos protocolos ya disponibles. Este protocolo, por lo tanto, enfatiza la importancia del método de incrustación, la orientación de corte, un sistema dinámico frente a uno estático y la relevancia de un volumen mínimo de cultivo. Este protocolo se puede establecer y reproducir de forma sencilla en la mayoría de los laboratorios que tienen acceso a un cortador de tejidos básico. En conjunto y siguiendo este protocolo, el PCLS puede permanecer vivo durante un mínimo de 4 días. PCLS es un modelo sencillo, económico y reproducible para estudiar el cribado fisiopatológico y terapéutico de órganos como el hígado.

Introducción

Los cortes de tejido cortados con precisión (PCTS, por sus siglas en inglés) son secciones delgadas de órganos. Permiten la preservación de la arquitectura del órgano replicando un mini-órgano, al tiempo que preservan el aspecto tridimensional de las células vecinas y la matriz extracelular. Es un modelo atractivo debido a su fácil acceso, ahorro de costos y características menos laboriosas, al tiempo que preserva la arquitectura del tejido.

Los PCTS llenan un vacío entre los estudios in vitro con células y la investigación in vivo con animales, superando la mayoría de las desventajas de ambos modelos. El PCTS se ha generado a partir de varios órganos, como el hígado¹, los intestinos ^2,3, el colon², el cerebro ^4,5, el pulmón ^6,7,8, el riñón ^9,10, el bazo^11,12, el corazón^13,14 pero también tumores^15,16. También pueden proceder de diversos animales, como el ratón¹, la rata^17,18, pero también el cerdo¹⁹ y los residuos quirúrgicos humanos 15,20,21. A pesar de que el PCTS requiere el uso de animales, lo que implica cuestiones éticas relacionadas, el órgano de un animal puede generar múltiples PCTS, reduciendo así el número de animales de acuerdo con las directrices NC3Rs (Reducción, Reemplazo, Refinamiento)²² y limitando las variaciones interindividuales.

El desarrollo de cortadores de tejidos mejorados, por ejemplo, los vibrátomos²³, ha permitido una transición de cortes cortados manualmente caracterizados por un grosor heterogéneo y una tasa de supervivencia baja a cortes más delgados y reproducibles con una integridad estructural mejor conservada.

Sin embargo, los protocolos para la preparación y el cultivo de PCTS y, más específicamente, para la preparación y el cultivo de cortes de hígado cortados con precisión (PCLS) varían significativamente en la literatura y carecen de estandarización, especialmente para parámetros esenciales como el equipo de corte, el contenido del medio y las condiciones de cultivo. Los protocolos también pueden variar notablemente en función del tejido de origen. Algunos de los protocolos requerirán la oxigenación del tampón o el cultivo con algunos sistemas de biorreactores complicados²⁴. Por lo general, se enfocan individualmente en diferentes aspectos técnicos o están diseñados para diferentes tejidos y, a menudo, pueden ser costosos y más difíciles de reproducir en el laboratorio promedio de una manera rentable.

Aquí, este protocolo reúne algunos puntos clave como el método de incrustación, la dirección de corte, el uso de transpocillos²⁵, un sistema de cultivo dinámico²⁶ y la importancia de un volumen mínimo de cultivo. Algunos de estos pasos se han optimizado previamente de forma independiente o en un contexto diferente, como la fibrosis²⁷ o la respuesta tumoral²⁸. Este protocolo también enfatiza la importancia de la incrustación usando ciertos tipos de cortadoras y la orientación del corte, que son parámetros difíciles de dominar y a menudo descuidados en la literatura. Este sencillo método genera PCLS mantenidos en cultivo durante un mínimo de 4 días con una fácil configuración y utilizando equipos de laboratorio estándar con acceso a un cortador de tejidos rudimentario.

Protocolo

Se compraron ratones CD57Bl/6J de tipo salvaje de Charles River Laboratories. Los ratones tenían libre acceso a comida y agua, alojados en jaulas ventiladas individualmente con condiciones controladas de temperatura y humedad y con un ciclo de luz de 12 horas. Los animales de 3 semanas de edad fueron sacrificados y los hígados fueron prontamente extraídos sin perfusión. Todo el trabajo con animales fue aprobado después de la revisión ética local por parte de la Junta de Revisión Ética y Bienestar Animal del University College London y se realizó bajo la licencia de proyecto del Ministerio del Interior PP9223137 y de acuerdo con la Ley de Procedimientos Científicos del Ministerio del Interior (Animales) (1986) y las directrices de ARRIVE. Se hicieron todos los esfuerzos posibles para limitar el daño a los animales de acuerdo con la práctica estándar de la Unidad de Servicios Biológicos del University College de Londres.

1. Prepárate para el experimento

1. El día antes de la cosecha, realice los siguientes pasos.
   1. Prepare 1 L de tampón Krebs-Henseleit (KREBS) disolviendo un vial de polvo Krebs en 1 L de agua estéril. Enfríelo a 4 °C y manténgalo sobre hielo húmedo.
   2. Desinfecte la bandeja con etanol al 70% y enjuague con PBS estéril. Mantenga la bandeja envuelta en papel de aluminio en el refrigerador durante la noche para ayudar a mantener un ambiente frío mientras corta.
   3. Rocíe todas las demás partes extraíbles con etanol, enjuague con PBS estéril, déjelas secar y manténgalas estériles. Esterilizar las cuchillas en autoclave y mantenerlas estériles hasta su uso.
   4. Prepare agarosa de bajo punto de fusión al 4% p/v en agua estéril. Una vez resuspendida y derretida, guarde la agarosa en la nevera a 4 °C.
2. El día de la cosecha y antes de la cosecha del hígado, realice los siguientes pasos.
   1. Derretir la agarosa de bajo punto de fusión al 4% y mantenerla al baño maría a 37 °C hasta su uso. Asegúrese de que la agarosa se haya enfriado a 37 °C y que todas las burbujas se hayan disipado antes de usarla.
   2. Prepare las placas de cultivo añadiendo respectivamente 2,6 mL, 1,5 mL y 0,7 mL por pocillo en placas de 6, 12 y 24 pocillos. Agregue insertos porosos de 8 μm a cada pocillo. Coloque las placas en una incubadora humidificada a 37 °C, 5% de_CO2 y 21% de_O2 . Esto ayudará a ajustar el pH mientras se calienta el medio, para que esté listo para el cultivo.
   3. Cultive las lonchas con insertos porosos de 8 μm para permitir el acceso a ambas caras de la loncha. Prepare el medio de la siguiente manera: Agregue al medio E de William's (WME), 2 mM de suplemento de L-glutamina, 10% de suero fetal bovino (FBS), 100 U/mL de penicilina y 100 μg/mL de estreptomicina, 10 μg/mL de gentamicina, 25 mM de solución de D-glucosa y 15 mM de solución HEPES.

2. Recolección de hígado y preparación (15 min)

1. Esterilice todos los instrumentos antes de la cosecha.
2. Anestesiar al ratón de acuerdo con los procedimientos locales para el cuidado de animales con fines científicos mediante el uso de una máscara de isoflurano. Antes de abrir la cavidad abdominal, apriete entre los dedos de los pies para asegurarse de que el animal esté correctamente anestesiado. Si el hígado se puede extirpar rápidamente, el ratón puede ser sacrificado por asfixia con CO₂ o dislocación cervical. Como el procedimiento es un procedimiento terminal, no use ungüento para los ojos, ya que esto no afectaría al animal.
3. Rocíe el abdomen con etanol al 70%. Opcional: Afeitar el ratón para evitar la contaminación con el vello.
4. Abrir la cavidad abdominal con pinzas estériles y tijeras cortando la piel y el peritoneo desde la mitad del abdomen. Diseccione el hígado suavemente de otros órganos o vasos y evite dañar los lóbulos.
5. Guarde todo el hígado inmediatamente en Krebs Buffer helado. Realice todos los pasos adicionales en el hielo a 4 °C y proceda a la preparación del hígado lo más rápido posible para evitar una mayor muerte celular.

3. Incrustación de los lóbulos hepáticos (25 min para cada lóbulo hepático)

1. Transfiera el hígado a una placa de Petri sobre hielo que contenga tampón Krebs helado, asegurándose de que todo el hígado esté completamente sumergido.
2. Separe cada lóbulo individualmente con pinzas romas y un cuchillo afilado y estéril para evitar dañar los lóbulos.
3. Elija el primer lóbulo para seccionar y mantenga los lóbulos restantes en un tampón Krebs helado hasta que estén listos para incrustar y cortar.
4. Corte todos los bordes para obtener un lóbulo más manejable con bordes rectos listos para incrustar. Esto también ayudará a eliminar parte de la cápsula fibrosa de Glisson para facilitar aún más el seccionamiento. Haga esto mientras mantiene las superficies del hígado húmedas en un tampón Krebs helado.
5. Coloque una placa de Petri de 3 cm (o similar) sobre hielo húmedo y vierta el 4% de agarosa de bajo punto de fusión (ya en un baño de agua a 37 ° C) en ella. Manténgalo bien en hielo para permitir que la agarosa se enfríe en dirección ascendente mientras evita que el lóbulo se hunda hasta el fondo y se incruste de manera uniforme.
6. Deje que la agarosa se enfríe aún más durante 30 s y coloque el lóbulo recortado en ella. El lóbulo se asentará en el centro del bloque de agarosa. El proceso de incrustación requiere práctica y optimización para adaptarse a todas las condiciones de laboratorio y experiencia personal.
7. Coloque el lóbulo incrustado, aún en hielo, en el refrigerador durante 5 minutos. A continuación, la agarosa debe estar claramente fijada.
8. Corta la parte exterior del bloque de agarosa. Desaloje el bloque de agarosa del plato.
9. Corta la agarosa en un tamaño más manejable, asegurándote de que la parte superior y el lado pegado a la plataforma del vibratomo estén paralelos al borde superior del lóbulo.
10. Comience el proceso de corte lo más rápido posible, pero asegúrese de que el bloque de agarosa se mantenga en un tampón Krebs helado y en hielo.

4. Producción de rodajas de hígado (40 min por lóbulo)

1. Ajuste el vibratomo para cortar a un grosor de 250 μm, con una velocidad de 5 y una frecuencia de 7 Hz. Estos son parámetros orientativos; Dependiendo del tipo de vibratomo utilizado, esto puede requerir optimización.
2. Rocíe el vibratomo y las áreas del banco con etanol al 70% antes de cortar para mantener el ambiente lo más estéril posible.
3. Coloque la bandeja en el vibratomo y vierta hielo a su alrededor. Coloque las cuchillas en el vibratomo en un ángulo de 10° hacia abajo y por debajo de la horizontal.
4. Llene el tanque de vibratomo con tampón Krebs helado. Coloque una capa delgada de pegamento de cianoacrilato sobre la plataforma.
5. Seque el borde del bloque de agarosa que se pegará a la plataforma con un pañuelo absorbente estéril.
6. Coloque el bloque de agarosa en la plataforma extraíble. Coloque el lóbulo en posición vertical para permitir que se corte transversalmente. Aunque el tamaño de las rodajas se reduce, esto facilita drásticamente el proceso de corte al limitar la presión contra el lóbulo durante el corte.
7. Espere 1 minuto a que el pegamento se asiente y sumerja la plataforma extraíble en el tanque y asegúrese de que el bloque de agarosa esté completamente cubierto con tampón Krebs.
8. Programe el vibratomo para el corte ajustando las posiciones de inicio y parada. Comience a cortar rodajas más gruesas inicialmente hasta que llegue al lóbulo del hígado.
9. Deseche la primera rebanada, ya que es posible que no se corte al grosor correcto. Para evitar dañar las rodajas, use una espátula para recoger las rodajas de hígado en lugar de pinzas o cepillos.
   NOTA: También se puede utilizar un pequeño cepillo desinfectado con etanol al 70% y enjuagado con PBS estéril para guiar suavemente el tejido durante el proceso de corte.
10. Repita el proceso hasta alcanzar el número requerido de rebanadas. El lóbulo puede ocasionalmente desprenderse de la agarosa, impidiendo su uso posterior. Recoja las rodajas en un tampón Krebs helado hasta el cultivo.

5. Incubación de rodajas de hígado

1. Transfiera las rodajas, con una espátula, a los pocillos preparados que contienen los medios y los insertos.
2. Coloque las placas en un agitador orbital, ajuste la velocidad a 130 rpm e incube utilizando una incubadora de cultivo celular convencional con 5% de CO2 y 21% de O2 a 37 °C. El volumen final de cultivo es de 2,6 mL, 1,5 mL y 0,7 mL por pocillo en placas de 6, 12 y 24 pocillos, respectivamente.
3. Coloque una placa vacía debajo de la placa de cultivo que contiene las rodajas en cultivo para permitir que se disipe el calor excesivo que se origina en la plataforma del agitador. Cambiar el medio cada 48 h.

6. Ensayo de supervivencia celular

1. Transfiera las rodajas a una placa de 48 pocillos que contenga 400 μL de medio E medio Williams completo precalentado y agregue 80 μL de reactivo de tetrazolio MTS (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolio).
2. Después de la incubación durante 1 h a 37 °C, 5% de CO₂ en un agitador, transfiera 200 μL de medio a una placa de 96 pocillos y mida la absorbancia a 490 nm utilizando un lector de placas de pocillos múltiples. Utilice las lonchas que se dejan en el banco en PBS y a temperatura ambiente durante 24 h como controles negativos.

7. Tinción histológica

1. Desparafinar y rehidratar las secciones con xileno y etanol, seguido de agua desionizada. Teñir las secciones con solución de hematoxilina durante 3 min.
2. Enjuague con agua desionizada durante 5 min. Sumerja rápidamente 10 veces en etanol ácido (1 mL de HCL concentrado y 400 mL de etanol al 70%).
3. Enjuague 2 veces en agua desionizada y seque el exceso de agua. Sumerja las secciones en eosina durante 30 s.
4. Deshidratar en etanol al 95%, luego en etanol al 100% durante 5 minutos, 3 veces cada uno. Sumerja las secciones en xileno 3 veces durante 15 minutos cada una. Coloque los cubreobjetos en los portaobjetos.

Resultados

En la cosecha, la perfusión del animal se omite deliberadamente para garantizar un procesamiento rápido del órgano y evitar daños en el órgano. El hígado se extrae rápidamente después de la incisión y se coloca inmediatamente en un tampón protector de órganos helado, por ejemplo, tampón Krebs^24,29. Aunque se ha descrito previamente el corte de tejido hepático fresco sin inclusión¹, la inclusi...

Discusión

Demostramos que la producción y el cultivo de PCLS se pueden lograr fácilmente al tiempo que garantizamos una vida media de al menos 4 días. Este protocolo recapitula cinco pasos críticos: el método de inclusión si se utiliza este tipo de vibratomo, la orientación del corte, un sistema dinámico de cultivo, un volumen mínimo de cultivo y el uso de insertos.

Los protocolos para la producción y el cultivo de PCLS están comúnmente disponibles. Sin emba...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
3 cm petri dish	Any		any suitable for cell culture
6, 12, 24 well culture plate	Any		any suitable for cell culture
Cyanoacrylate super glue	Any
D-Glucose	Gibco	A24940
Eosin	Merck	HT110316
Ethanol	Any
Fetal Bovine serum	ThermoFisher	26400044
Gentamycin	Gibco	15750060
Hematoxylin	Merck	51275
HEPES	Gibco	H0887
inserts 8um, for 12 well plates	Strastedt	83.3931.800
inserts 8um, for 24 well plates	Strastedt	83.3932.800
inserts 8um, for 6 well plates	Strastedt	83.3930.800
KREBS	Merck	K3753
Laminar Flow Hood			Hepa air filtration
Low melting agarose	ThermoFisher	16520050
MTS tetrazolium reagent	Abcam	ab197010
multi-well plate reader	Any
PBS tablets	ThermoFisher	P4417
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140-122
Scalpel blade	Any
Surgical forceps	Any		with a flat square-tip
Surgical scissors	Any
Vibratome	Leica	VT1000 S
William’s Medium E with GlutaMAX (WME)	ThermoFisher	W4125