Un método rápido para confinar y manipular de forma segura a las abejas en el campo

Resumen

Demostramos un método probado para el manejo seguro de abejas recolectadas en el campo. Este método permite una rápida manipulación, identificación, muestreo genético y confirmación de las interacciones planta-insecto a través del polen recolectado durante el muestreo. Fácilmente adaptable, este enfoque ofrece un medio rentable y no letal para estudiar grupos de insectos raros.

Resumen

Mejorar la comprensión de la biología básica y la ecología de muchos insectos polinizadores, en particular los taxones especializados o raros, es una prioridad para muchos investigadores. Como tal, a menudo es necesario confinar temporalmente los organismos recolectados en el campo de manera no perjudicial para obtener información o respaldar estudios adicionales. Este protocolo representa un método de campo completamente probado, rápido y económico para el manejo seguro de abejas de interés para la conservación que se puede adaptar fácilmente a las necesidades específicas del proyecto, incluida la identificación de organismos, la eliminación de polen, el marcado y / o la recolección de muestras de tejido no letales para análisis genético. Esta metodología puede servir como una opción adicional en la caja de herramientas del investigador para utilizar cuando se presentan ciertos escenarios. Se prevé que esta metodología pueda adaptarse para su uso con otras especies de insectos, así como para individuos de diferentes niveles de experiencia y habilidad. Puede ser de gran valor para los investigadores que estudian abejas especializadas o que realizan estudios específicos de hospedadores. La recopilación de datos que es posible gracias a este protocolo será invaluable para ayudar a los investigadores a abordar las brechas de datos críticas para muchas especies de polinizadores, las estructuras de redes de plantas y polinizadores y las iniciativas de conservación y gestión de polinizadores.

Introducción

Un creciente cuerpo de evidencia apoya la disminución de las poblaciones de abejas silvestres y otros polinizadores y los cambios concomitantes en la comunidad de polinizadores 1,2,3,4. Las pérdidas continuas amenazan el servicio mismo de la polinización por insectos, vital para el mantenimiento de la biodiversidad, la función de los ecosistemas y la producción agrícola⁵. Además, para muchas abejas silvestres, especialmente las especies raras, existen importantes lagunas de conocimiento que pueden obstaculizar las acciones adecuadas de gestión y conservación ^6,7.

Para ayudar a abordar estas deficiencias de datos, los investigadores han desarrollado una variedad de métodos para estudiar los insectos polinizadores, el uso del hábitat asociado y sus preferencias florales. Si bien las trampas de sartén, las trampas de veleta azul, las trampas de malestar, las trampas de emergencia y la recolección directa con redes manuales se utilizan comúnmente, muchos de estos métodos tienen inconvenientes significativos 8,9,10,11. Los métodos comúnmente empleados para identificar al polinizador pueden resultar en la mortalidad del organismo, independientemente de si el espécimen debe identificarse en un entorno de laboratorio (por ejemplo, usando un microscopio). La mortalidad puede ser justificable y necesaria para muchos estudios con insectos. Sin embargo, cuando se trabaja con insectos en peligro, raros o poco estudiados cuyos estados de población son limitados o inciertos, los investigadores deben mitigar la mortalidad, las lesiones o el estrés de los organismos para reducir la probabilidad de afectar negativamente a estas poblaciones de insectos. Por lo tanto, cuando se trabaja con especies en riesgo o especies que pueden identificarse fácilmente por sus características distintivas clave, se deben adoptar enfoques de muestreo menos destructivos si es posible.

Los métodos no letales que se han propuesto para la recolección de material genético de las abejas incluyen la recolección de heces, exuviae¹² y puntas de alas¹³. Sin embargo, el uso de estos métodos en abejas recolectadas en el campo puede ser insostenible debido al tiempo requerido y/o al impacto potencial en las alas, lo que afecta negativamente el vuelo y otros comportamientos. Se ha demostrado que la eliminación parcial de las antenas no compromete la supervivencia de las abejas euglosinas muestreadas¹⁴. Del mismo modo, el muestreo de la porción terminal del tarso de la mitad de la pata no redujo significativamente la supervivencia de las obreras de Bombus terrestris ¹⁵. Un método adicional de muestreo no letal consiste en recolectar residuos de proteínas sumergiendo temporalmente a las abejas en una solución tampón y luego liberándolas¹⁶. El análisis de supervivencia mostró que no hubo diferencias significativas entre las abejas enjuagadas con tampón y las no enjuagadas. Cada técnica tiene limitaciones, que deben tenerse en cuenta a la hora de abordar preguntas de investigación específicas y objetivos generales del proyecto.

La identificación taxonómica precisa de los organismos es fundamental para una investigación eficaz. Sin embargo, para muchos taxones de insectos polinizadores, es extremadamente contingente de la especie de interés y del nivel de conocimiento y experiencia del investigador u observador. Si bien muchas especies de abejas se pueden identificar en el campo, tener evidencia que respalde la observación puede ser fundamental. Si bien la mayoría de los estudios de polinizadores suelen recolectar y retener individuos como evidencia, el uso de fotos y videos, así como la videografía tridimensional que utiliza la realidad virtual, se pueden utilizar como un indicador para distinguir ciertas especies sin sacrificar los individuos que se observan¹⁷. La diferenciación entre algunas especies puede requerir una atención especial y fotografías de características morfológicas específicas; En estas situaciones, los organismos deben ser capaces de ser manipulados y confinados a una posición única de modo que los complejos caracteres distintivos puedan ser fotografiados de forma fiable.

El confinamiento temporal de las abejas para su identificación se puede hacer de varias maneras, incluyendo el enfriamiento del espécimen y/o el uso de dióxido de carbono para ralentizar las abejas^18,19. Sin embargo, estos métodos pueden alterar el comportamiento, lo que hace que las abejas tratadas tarden más en recuperar la actividad, lo que posiblemente afecte la búsqueda de alimento, la aptitud del organismo o aumente el riesgo de depredación 20,21,22. Además, estas técnicas aumentan en última instancia el tiempo que los organismos están confinados y manipulados. Esto, a su vez, aumenta el estrés del organismo y el tiempo de procesamiento en el campo. Por lo tanto, sería muy conveniente contar con metodologías más seguras y eficientes.

Varios estudios han utilizado el polen recolectado de las abejas u otras fuentes para comprender mejor las preferencias de búsqueda de alimento, construir redes de interacción planta-polinizador, identificar la contaminación ambiental (por ejemplo, residuos de pesticidas) y evaluar la ecología nutricional 23,24,25,26,27,28,29. Muchas abejas se acicalan solas cuando están confinadas en un contenedor. Por lo tanto, se han utilizado métodos no letales de muestreo de polen³⁰ (por ejemplo, tubos de microcentrífuga). Sin embargo, en los casos en los que no se lleva a cabo el autoaseo, el uso de un recipiente más táctil, como las bolsas de plástico resellables utilizadas en este protocolo, permite aplicar una presión suave en partes específicas del cuerpo para que el polen entre en contacto con la bolsa de plástico, lo que aumenta la probabilidad de obtener una muestra de polen que el uso de recipientes duros tradicionales.

Aquí, presentamos un protocolo que ha sido bien probado en tres taxones de abejas en riesgo. Si bien requiere mucha mano de obra, permite la recopilación completa de datos de los insectos polinizadores al tiempo que minimiza la amenaza de mortalidad para los organismos individuales. El objetivo general del uso de esta metodología es proporcionar un medio seguro y eficaz para capturar, identificar y liberar insectos de manera segura. Una ventaja añadida de este protocolo es que supera muchas de las limitaciones de la recolección tradicional de insectos. Proporciona una manera fácil de marcar individuos, recolectar material genético no letal y recolectar muestras de polen, todo mientras minimiza el tiempo de manejo y el estrés en el organismo. Si bien los métodos tradicionales de recolección de insectos tienen muchos beneficios³¹, para ayudar a superar algunas de sus limitaciones, establecimos una alternativa para que los insectos puedan ser confinados para su identificación antes de una liberación rápida y segura. Dependiendo de los objetivos del proyecto, también se pueden tomar medidas adicionales mientras la abeja está confinada para recopilar otros datos importantes.

Protocolo

1. Preparación de la colección de campo

1. Confirmar los objetivos del proyecto (por ejemplo, identificación de organismos, muestreo de tejidos genéticos, etc.).
2. Revise la Tabla de Materiales y reúna todos los elementos relevantes específicos de los objetivos del proyecto.
3. Asegúrese de que todos los equipos digitales (por ejemplo, teléfonos inteligentes, cámaras, sistemas de posicionamiento global [GPS] portátiles) estén completamente cargados y que las baterías de repuesto estén cargadas y empaquetadas.

2. Captura y seguridad del organismo

1. Registre los parámetros del sitio de interés al llegar al campo, incluida la fecha, la hora de inicio, el sitio/ubicación del campo y cualquier otra información relevante (por ejemplo, condiciones climáticas, plantas dominantes de cobertura del suelo, plantas en floración, etc.) que pueda ser necesaria (Figura 1).
2. Capture una abeja individual de interés utilizando la técnica de red adecuada. Utilice redes manuales a través de una red aérea para insectos o una red de barrido según la especie focal.
   NOTA: Otras técnicas de captura, como la recolección a través de un vial/tubo centrífugo, también podrían usarse para la captura de insectos.
3. Observe visualmente el espécimen a través de la bolsa de red para determinar si se parece al taxón de interés. De lo contrario, libere el espécimen de manera segura y continúe con la prospección.
4. Si el espécimen parece ser la especie focal, asegure el espécimen dentro de la bolsa de red para que no pueda escapar (por ejemplo, superponiendo la parte superior de la bolsa de red sobre el marco, retorciendo o confinando el cuello de la bolsa de red o cerrando cualquier posible salida).
5. Reúna la bolsa de muestras con cierre hermético y abra la bolsa de muestras.
6. Asegúrese de que la abeja de interés esté cerca de la punta de la bolsa de red.
7. Con una mano, agarre la bolsa de red inmediatamente debajo del espécimen. Sostenga la bolsa de red de manera que la punta (donde está confinado el insecto) esté orientada hacia arriba y la abertura de la red (es decir, el aro) cuelgue debajo.
   NOTA: La mayoría de los insectos son fototróficos y, cuando están confinados, generalmente vuelan o se arrastran hacia la luz.
8. Con la otra mano (es decir, la mano que no sostiene la bolsa de red), guíe la bolsa de muestra resellable en la abertura de la red y a través de la bolsa de red hasta que llegue a la mano inmediatamente debajo de la muestra.
9. Suelte con cuidado el agarre de la mano, confinando la muestra lo suficiente para permitir que la mano que sostiene la bolsa de muestra resellable se mueva hacia el área confinada con la muestra. Tenga en cuenta la ubicación del espécimen dentro del área confinada para reducir la probabilidad de ser picado, dañar el espécimen y escapar.
10. Manipule la bolsa de muestra resellable para que se abra lo suficiente como para permitir que ingrese el espécimen de insecto. Haga esto aplicando presión a ambos lados del sello o girando la bolsa con el pulgar y el dedo medio por debajo del sello.
11. Coloque la abertura de la bolsa de muestra resellable sobre la muestra y maniobre suavemente el insecto dentro de la bolsa. Como se mencionó anteriormente, dado que la mayoría de los insectos son fototróficos, oriente la mano que contiene la bolsa de muestra resellable hacia el sol / cielo, facilitando así el movimiento de la muestra dentro de la bolsa.
12. Una vez que la muestra esté dentro, selle firmemente la bolsa de muestra con cierre hermético.
13. Retire la bolsa de muestra resellable que contiene el espécimen de la mosquitera.
    NOTA: Dado que los insectos pueden sobrecalentarse rápida y letalmente en bolsas selladas, mantenga la muestra fuera de la exposición directa al sol, idealmente en un lugar sombreado o en un recipiente aislado hasta el procesamiento, y limite el tiempo de procesamiento.

3. Identificar el organismo

1. Inspecciona de cerca el espécimen para confirmar que es un taxón de interés. Si se trata de una especie diferente, libérala de manera segura y continúa con la prospección.
   NOTA: Para evitar daños al espécimen, nunca aplique presión directa al insecto mientras esté dentro de la bolsa. Las muestras se pueden inmovilizar aplicando una presión suave sobre el plástico o estirando el perímetro de la bolsa para que la bolsa se tense alrededor de la muestra, limitando así el movimiento.
2. Si la identidad de la especie se puede confirmar visualmente de manera fácil y precisa, lleve un cupón de foto (Figura 2). Registre cualquier información adicional necesaria sobre el espécimen (por ejemplo, hora de captura, ubicación GPS específica, planta visitada, marcas únicas, observación de tamaño o coloración, comportamiento antes de la captura, etc.).
3. Si es necesario inspeccionar características físicas específicas para confirmar la identidad, tome fotografías macro detalladas que destaquen esas características clave a través de la bolsa de muestra resellable (Figura 2).
4. Si no se pueden obtener fotos de calidad suficiente para el discernimiento de características a través de la bolsa de muestras, exponga las partes del cuerpo de interés de la muestra para una inspección minuciosa cortando una de las dos puntas de las esquinas no selladas de la bolsa de muestra (es decir, las esquinas que están cosidas juntas o que no se pueden volver a sellar). Por ejemplo, corte un pequeño agujero para exponer solo la cabeza, el abdomen o la pierna (Figura 3A-C). Para ello, manipule la muestra de modo que la parte del cuerpo de interés se mueva primero hacia el agujero de corte/esquina.
   NOTA: Es posible que sea necesario modificar el tamaño y la posición del agujero cortado en la bolsa y la orientación del insecto para obtener la fotografía necesaria.
5. Una vez que se haya realizado la identificación, pase a las secciones relevantes para los métodos posteriores y deseados. Véase la sección 4 para la técnica de eliminación de segmentos de antenas, la sección 5 para el marcado de insectos y/o la sección 6 para la obtención de muestras de polen.

4. Obtención de muestras genéticas no letales de antenas

1. Use unas tijeras para cortar en diagonal una de las dos esquinas no selladas (es decir, las esquinas que están cosidas juntas o que no se pueden volver a sellar) de la bolsa de muestra resellable. Asegúrese de que el corte realizado sea mínimamente mayor que el ancho de la cabeza de la abeja (Figura 4).
2. Manipule la muestra para que se mueva de cabeza hacia el orificio de corte/esquina.
   NOTA: Este paso se puede adaptar para recolectar otras muestras de tejido para análisis genético (por ejemplo, pierna completa, pierna parcial). En consecuencia, es posible que sea necesario modificar el tamaño y la posición del orificio cortado en la bolsa y la orientación del insecto para obtener la muestra necesaria.
3. Una vez que la cabeza de la abeja sobresalga de la bolsa, aplique suavemente presión sobre el plástico circundante para que se tense alrededor del insecto, restringiendo el movimiento (Figura 3A).
4. Si el orificio es demasiado grande, enrolle la bolsa sobre sí misma para restringir aún más la abertura del orificio y asegurar la muestra. Si no está seguro del tamaño apropiado del orificio, realice los pasos 4.2 y 4.3 dentro de una red de insectos o una jaula de vuelo para asegurarse de que el espécimen no se escape por completo. Use una bolsa adicional si el corte de esquina original es demasiado grande.
5. Coloque la bolsa de manera que la cabeza del insecto esté directamente sobre el recipiente de recolección (por ejemplo, un tubo de microcentrífuga/vial que contenga solución tampón/etanol) y que el recipiente para la muestra genética esté debidamente marcado con la identificación única de la muestra correspondiente a todos los demás datos de la muestra (Figura 3D).
6. Con unas tijeras de disección limpias y esterilizadas, corte una parte de un segmento de antena. Inspeccione visualmente el recipiente para confirmar que la muestra está dentro del recipiente.
   NOTA: Al cortar, es útil trabajar sobre un sustrato limpio, esterilizado y de color claro (por ejemplo, Kimwipe). Esto garantiza que, si la muestra no cae en el recipiente de recogida de muestras, se pueda recuperar fácilmente con pinzas con un riesgo mínimo de contaminación.
7. Asegure la tapa del recipiente de recolección de muestras de tejido y gire el recipiente para que la muestra quede suspendida dentro de la solución (por ejemplo, solución tampón/etanol).
8. Coloque el recipiente de recolección de muestras de tejido (con la muestra de antena) en un recipiente seguro, idealmente en un lugar fresco y sombreado protegido de la luz solar directa y/o temperaturas extremas, como un enfriador de campo.
9. Libere el espécimen de manera segura cerca del punto original de captura.
   NOTA: El espécimen también puede ser marcado (ver sección 5) antes de la liberación para identificar fácilmente que ha sido muestreado si se vuelve a avistar/recapturar.

5. Marcaje del organismo

1. Con la muestra en la bolsa de muestra resellable, corte un pequeño agujero en el medio de la bolsa de muestra.
   NOTA: Este agujero es adicional al agujero creado en la sección 4. El agujero no debe ser más grande que el área del tórax del insecto. La posición del lugar donde se debe cortar el agujero puede variar según el tamaño del insecto y el área de marcado deseada.
2. Aplicando una presión suave al plástico en ambos lados de la muestra, maniobre el insecto de manera que el tórax quede directamente debajo del orificio (es decir, que la parte superior del tórax quede expuesta a través de la bolsa). Continúe con una presión suave para asegurarse de que la muestra permanezca en su lugar (Figura 5A).
   NOTA: Otras áreas de marcado pueden ser mejores para ciertos insectos (Figura 5B). A algunos usuarios les resulta más útil hacer el agujero existente (de la sección 4) más grande y agarrar a la abeja sosteniendo su tórax a medida que emerge (Figura 5C). Este enfoque puede aumentar la probabilidad de ser picado. Además, los dispositivos de marcado de reinas de abejas melíferas se pueden modificar para confinar y marcar abejas si al usuario le resulta más fácil. Sin embargo, este método requiere la transferencia a un dispositivo diferente y podría contaminar las muestras de polen.
3. Usando un rotulador de marcado de pintura (u otro material de marcado que se considere apropiado para el taxón de interés), marque el espécimen de acuerdo con la metodología específica del proyecto predeterminada.
   NOTA: Los métodos de marcado diferirán según los objetivos y pueden ser simples, lo que indica que la persona fue capturada, o complejos, lo que permite la identificación de las personas (por ejemplo, utilizando un código de color o un patrón único) (Figura 5C).
4. Sostenga la muestra en su lugar hasta que la marca aplicada esté adecuadamente seca.
5. Fotografíe a la persona marcada para confirmar la coloración única y la posición del color.
   NOTA: Los individuos recapturados pueden ser fotografiados fácil y rápidamente directamente a través de la bolsa de muestra resellable (Figura 5D).
6. Libere el espécimen de manera segura cerca del punto original de captura.

6. Recolección de muestras de polen

1. Con el espécimen en la bolsa de muestra resellable, inspecciónela cuidadosamente en busca de polen visible.
   NOTA: Como el tipo y la cantidad de polen varían enormemente, a veces el polen no es visible en el espécimen a simple vista. Si ya se han completado los pasos anteriores, es posible que los restos de polen del espécimen ya estén en la bolsa.
2. Si el polen es visible en la muestra, limite el movimiento de la muestra aplicando una presión suave al plástico en ambos lados.
3. Con un dedo, frote o empuje suavemente el plástico contra las setas o partes del cuerpo que contengan polen para facilitar la eliminación del polen.
4. Si el polen no es visible en la muestra, maximice el contacto entre la muestra y el plástico para ver si se eliminan pequeños restos de polen del tegumento.
5. Confirme visiblemente que el polen está en la bolsa de muestra resellable, si es posible (Figura 4).
6. Libere el espécimen de manera segura cerca del punto original de captura.
7. Selle firmemente la bolsa de muestras resellable que contiene la muestra de polen.
   NOTA: Si se hizo un agujero en la bolsa de muestra resellable, debe colocarse dentro de otra bolsa de muestra resellable para evitar la contaminación o la pérdida de polen.
8. Etiquete la bolsa de muestra resellable con una identificación de muestra única correspondiente al insecto individual y otros datos (por ejemplo, identificación de la especie de insecto, fecha, ubicación, hora, sexo, registro de visitas florales, etc.).
9. Coloque la bolsa de muestra resellable con la muestra de polen en un recipiente seguro, idealmente en un lugar más fresco, para protegerla de la luz solar directa y/o temperaturas extremas.
   NOTA: Si corresponde, siga los protocolos específicos del proyecto para la preservación del polen en el campo (por ejemplo, análisis genético, morfología del polen).

Resultados

Esta metodología se ha utilizado para tres especies de abejas en riesgo (Osmia calaminthae, Caupolicana floridana y C. electa) en el sureste de los Estados Unidos. Hasta la fecha, cientos de abejas y avispas han sido recolectadas y liberadas de manera segura. Ninguna abeja murió mientras se usaba esta metodología; Aquellos designados como especímenes de cupón y mantenidos como un nuevo registro de ubicación con la agencia administradora apropiada fueron sacrificados apropiadamente después de la recopilación de datos. En la Tabla 1 se muestran las diferentes características morfológicas evaluadas, así como otros datos cuantificables que se pueden recoger con este protocolo 14,32,33,34,35,36.

Figura 1: Ejemplo de hoja de datos que muestra los datos que se pudieron recopilar mientras se está en el campo. Los datos específicos recopilados variarán en función de los objetivos del proyecto. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Fotos para servir como comprobantes. Tomar fotos para que sirvan como comprobantes del suceso es esencial para fines de informe. Las fotos de las características distintivas de identificación son necesarias cuando varias especies comparten características similares. Este Anthidium maculifrons que se encuentra en Florida se puede distinguir de otros del género en función del amarillo en su escapo y cabeza. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Colocación del orificio en la bolsa de muestra resellable. La ubicación del orificio en la bolsa de muestras resellable se puede modificar para exponer partes específicas del cuerpo de interés para fotografías o muestras genéticas. En esta foto compuesta, la (A) cabeza, (B) el abdomen y (C) la pata de la abeja están expuestos a la fotografía. Una vez que la abeja está confinada y no puede moverse, a menudo descansa y se puede posicionar para obtener una macrofotografía. (D) También se puede tomar una muestra genética cuando la abeja está en estas posiciones. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Bolsa de recolección con una abeja que muestra una esquina cortada en diagonal. Si desea observar de cerca la cabeza de la abeja, el corte en la esquina de la bolsa variará en tamaño según el tamaño de la cabeza de la abeja. Se pueden encontrar secreciones de polen e incluso néctar en la bolsa para su futura identificación de polen. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Imágenes de la bolsa de muestra resellable con abejas. Para evitar que te piquen mientras marcas a la abeja, se puede hacer un agujero en la bolsa y el tórax (A) se puede colocar debajo del agujero. (B) Dependiendo del tamaño de la abeja, también se puede marcar en el abdomen. (C) Alternativamente, la abeja también puede ser liberada por el orificio de la esquina y comprimida en el tórax para su marcado. Esta técnica puede aumentar la posibilidad de ser picado, pero parece minimizar el manchado del bolígrafo. Se puede usar un coloreado/numeración único para diferenciar entre individuos. (D) Los futuros especímenes recapturados pueden ser fotografiados rápida y fácilmente a través de la bolsa de muestra resellable y liberados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Características morfológicas evaluadas con este protocolo. Las muestras también se pueden manipular para observar y documentar numerosos rasgos no representados en esta tabla (por ejemplo, forma de tergita/esternita, longitud total, peso, número de dientes, venación de las alas, distancia intertegular, etc.). Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Discusión

Este protocolo describe un método de campo para manejar e inspeccionar de manera segura abejas raras con el objetivo final de obtener la información deseada sobre muestras no letales o cupones y liberar de manera segura a los individuos focales en la naturaleza en el punto original de captura. Los beneficios de este protocolo sobre otros métodos de recolección, como el uso de viales, son que el espécimen se puede confinar de manera segura para permitir un examen detallado de las características clave y una identificación confiable, lo que limita el daño tanto para el insecto como para el investigador. Por el contrario, al igual que ocurre con otras metodologías^18,19, este protocolo no requiere que la muestra esté anestesiada; Se puede muestrear y liberar rápidamente con una manipulación mínima. Las bolsas de muestras resellables son de bajo costo, fáciles de adquirir, livianas, extremadamente portátiles y reciclables, lo que las convierte en una excelente alternativa a los tubos de centrífuga. Como carecen de la rigidez de algunas alternativas (por ejemplo, tubos de halcón u otros recipientes duros), es importante tener especial cuidado al manipular especímenes de insectos vivos. Si se va a tomar un espécimen completo como cupón, colocarlo en un recinto resistente reducirá el daño potencial al espécimen.

Es beneficioso que los investigadores que utilizan este método tengan experiencia en el manejo de abejas y/u otros insectos, ya que aplicar demasiada presión sobre los especímenes mientras están en la bolsa podría provocar lesiones o la muerte. Para obtener más experiencia en el manejo de abejas, los investigadores novatos deben practicar este protocolo utilizando especies más comunes (por ejemplo, abejas melíferas). La práctica ayudará a minimizar las lesiones o la mortalidad del insecto. Es importante tener en cuenta que, dependiendo del taxón focal, puede haber limitaciones para esta metodología. El tamaño reducido de taxones específicos puede requerir el uso de equipos de fotografía macro más costosos y especializados y/o el uso de microscopios de campo, ya que sus características pueden no poder aislarse y fotografiarse con los materiales enumerados en este procedimiento, cuanto más pequeño sea el objetivo, más difícil puede ser obtener imágenes adecuadas³⁷. Además, en los casos en que se requieren partes del cuerpo inaccesibles (por ejemplo, lengua, genitales, etc.), pueden estar justificados otros métodos de identificación. Los genitales se encuentran entre los rasgos diagnósticos más informativos para los insectos, que pueden ser muy variables entre especies y algo estables dentro de ellas^38,39. En este caso, pueden ser necesarios métodos letales, como la disección. Sin embargo, en el caso de las especies difíciles de identificar, se puede utilizar el uso de muestras genéticas pequeñas y no letales para la identificación después de la recolección en el campo⁴⁰, y la metodología descrita aquí se puede utilizar para recolectar dichas muestras. También se están desarrollando modelos estadísticos para ayudar a asociar las imágenes y la secuenciación del ADN para la identificación de insectos⁴¹.

Otra limitación de la metodología presentada aquí se refiere a la probabilidad de ser picado al realizar este protocolo, especialmente cuando se tiene un agujero en la bolsa. Este protocolo, sin embargo, minimiza la probabilidad de ser picado; Los autores rara vez han sido picados a través de las bolsas de especímenes mientras manipulan especímenes. También debe tenerse en cuenta que algunas especies de abejas, escarabajos y avispas han podido cortar las bolsas usando sus mandíbulas, por lo que se debe tener cuidado al determinar si este enfoque funcionará para los taxones de interés y, en estos casos, se recomendarían bolsas de plástico más gruesas u otras metodologías. En todos los casos, los usuarios deben minimizar el uso de plásticos de un solo uso y reciclarlos cuando sea posible.

El taxón focal para el desarrollo de este protocolo fue la abeja calamintha azul, Osmia calaminthae (Hymenoptera: Megachilidae), que mide aproximadamente 10-11 mm en tamaño³². Desde que desarrollaron este método, los autores lo han empleado en una variedad de otros himenópteros de varios tamaños, incluidas las especies más grandes de Bombus (Hymnenoptera: Apidae) y las especies de Caupolicana , C. electa y C. floridana (Hymenoptera: Colletidae). Caupolicana electa puede variar de 18-23 mm, mientras que C. floridana puede variar de 16-18 mm³³. Para ayudar a minimizar cualquier impacto negativo en las especies en riesgo, en peligro o incluidas en la lista, se recomienda probarlo primero en sustitutos estrechamente relacionados y/o comunes para ayudar a adquirir experiencia y desarrollar competencia. El exoesqueleto de las abejas y otros insectos puede variar, y los especímenes menos robustos deben tratarse con cuidado. En situaciones en las que se estudian cuerpos de insectos más pequeños o más blandos, esta metodología puede no ser suficiente. Los usuarios deben determinar qué partes de esta metodología serán apropiadas para su taxón focal.

Más allá del objetivo principal de confinar los organismos recolectados en el campo para su identificación, este protocolo puede modificarse para realizar diversas tareas relacionadas con la investigación para las cuales las abejas deben estar confinadas de manera segura. Por ejemplo, los organismos se pueden pesar en el campo mientras se encuentran en las bolsas de muestras resellables. Los investigadores también pueden tomar varias medidas de los especímenes usando calibradores mientras el insecto está limitado. Por ejemplo, la estimación de la capacidad de localización de las abejas se puede hacer utilizando el tamaño corporal⁴²; Nuestra metodología podría ayudar a adquirir datos que faciliten dicha estimación. Del mismo modo, en lugar de usar calibradores, los investigadores pueden colocar y fotografiar una regla/barra de escala y/o una tarjeta de color directamente detrás del espécimen para medir las características morfológicas clave cuando procesen las imágenes más adelante. Las aplicaciones futuras de este método podrían aprovechar los avances en inteligencia artificial y aprendizaje automático. La identificación, tanto en el campo como en el laboratorio, podría simplificarse mediante el uso de dispositivos inteligentes, minimizando así el tiempo de manipulación y el estrés en las muestras.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
30x 60x illuminated jewelers eye loupe magnifier	JARLINK		Hand lens (if necessary) for observing diagnostic characteristics
Aerial hand net
Bleech in wash bottle			Only needed for non-lethal genetic sampling
Blunt-tip kids scissors	Fiskar		Blunt-tip scissors are beneficial because they can safely be kept in pockets
Ethanol in wash bottle			Only needed for non-lethal genetic sampling
FD-1 flash diffuser	Olympus		Flash Diffuser to illuminate specimen while taking voucher photos
Field clipboard
Field cooler
Fine forceps
Fine point oil-based paint marker set	Sharpie		Pens to mark bees
Kimwipes	Kimtech
Microcentrifuge tubes			Only needed for non-lethal genetic sampling
Resealable sample bag	Amazon		Dependent on specimen of interest. We prefer 50.8 mm x 76.2 mm or 50.8 mm x 50.8 mm  - Edvision 2" x 3" Plastic Bags, 200 Count 2 Mil Transparent Resealable Zipper Poly Bags, Reclosable Storage Bags for Jewelry Supplies, Beads, Screws, Small Items  - Soft 'N Style 500 Count Resealable Zipper Poly Bags, 2 by 2-Inch, 50mm by 50mm, Clear
Stainless steel iris dissecting scissors			More precise than blunt-tipped scissors.  Should be kept in a secure location.
TG-7 or similar camera	Olympus		Camera with macro setting to take voucher photos