Cultivo glial entérico equino y aplicación al estudio de un mecanismo inflamatorio neural en el cólico equino

Resumen

La glía entérica es cada vez más reconocida por su papel en la homeostasis intestinal y los procesos patológicos, incluidas las complicaciones postoperatorias. Los pacientes equinos que se recuperan de una laparotomía exploratoria de emergencia presentan un alto riesgo de afecciones inflamatorias postoperatorias, lo que destaca la importancia de establecer un cultivo primario de células primarias de glía entérica equina repetible para su estudio.

Resumen

Las condiciones inflamatorias postoperatorias del cólico equino (abdomen agudo) contribuyen no solo al aumento del costo del cliente, la incomodidad del paciente y el tiempo de hospitalización, sino que, en muchos casos, resultan potencialmente mortales. Una población única de células intestinales, la glía entérica, es cada vez más reconocida por su papel en la detección del entorno gastrointestinal y la comunicación con los tipos de células circundantes. Las interacciones entre la glía entérica y el epitelio intestinal pueden resultar críticas para establecer cómo la glía entérica equina puede alterar la barrera mucosa para modular la inflamación en la salud y los cólicos.

Para estudiar esta interacción, presentamos un método para establecer cultivos primarios de glías entéricas equinas a partir del yeyuno equino y exponer los cultivos a condiciones inflamatorias que se sabe que están presentes en los cólicos. Los cultivos gliales entéricos primarios se obtuvieron de caballos adultos sacrificados por razones no relacionadas con los cólicos. Las vellosidades intestinales y la lámina propia se microdiseccionaron para exponer la submucosa. La submucosa aislada se sometió a digestión enzimática con colagenasa, proteasa y albúmina sérica bovina durante 2-3 h. A continuación, la digestión mecánica que involucró centrifugación, pipeteo y filtros de celdas (40-100 μm), produjo un pellet utilizado para el recubrimiento en pocillos recubiertos de poli-L-lisina de 0,05 mg/mL a una concentración de ~400.000 células/300 μL de medio.

Después de la confluencia y el primer paso, las células gliales entéricas se expusieron a IL-1β recombinante equina (0, 10, 25 ng) durante 24 h. Para modelar las interacciones epitelio-glial en el momento del cólico, se añadió directamente a las monocapas de yeyuno equino confluentes mientras se medía la resistencia eléctrica transepitelial (TEER) utilizando una cámara EndOhm de doble electrodo. Estos datos demuestran solo una de las muchas aplicaciones potencialmente impactantes del cultivo de glía entérica equina.

Introducción

El cólico equino es la queja médica más prevalente que se presenta para consulta de urgencia¹. Con hasta un 17% de esos caballos que requieren corrección quirúrgica, los esfuerzos para aumentar los resultados postoperatorios deben estar a la vanguardia de^{la investigación médica} equina. En la actualidad, los pacientes con cólicos postoperatorios experimentan un alto riesgo de padecer varios trastornos potencialmente mortales, como sepsis/shock endotoxémico (12,3% de los pacientes) y íleo postoperatorio (13,7% de los pacientes)³. A pesar de los avances en el tratami....

Protocolo

Se obtuvieron cultivos primarios de glía entérica equina de tres caballos sacrificados humanamente con una sobredosis de un barbitúrico por razones no relacionadas con este estudio. Los caballos seleccionados para los estudios de cultivo eran caballos adultos sin antecedentes actuales de enfermedad gastrointestinal.

1. Cultivo primario de glía entérica equina submucosa

1. Cultive monocapas epiteliales equinas a partir de criptas yeyunales obtenidas de tres caballos equinos adultos separados.
   1. Cubra las placas de 24 pocillos con solución de recubrimiento durante 2 h a 37 °C o to....

Discusión

El objetivo de este estudio fue desarrollar un método repetible de cultivo primario de glía entérica submucosa equina y demostrar su aplicación para modelar las interacciones epitelio-gliales en el momento del cólico. El aislamiento y cultivo de la glía entérica, que es novedoso en el caballo, ha demostrado ser beneficioso para comprender las vías de las enfermedades intestinales en modelos de cerdos y roedores y en humanos 6,7,13,14.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 M HEPES buffer	Gibco	15630-080
10 mM HEPES	Life Technologies	15630-106
2 mM GlutaMAX	Life Technologies	25050-061
4’6-Diaminidino-2-Phenylindol	Invitrogen	D3571
Advanced DMEM/F12	Life Technologies	12634-010
Alpha smooth muscle actin antibody	Abcam	7817
Amphotericin B	Sigma	AA9529	4.4 g/mL stock aliquots, final concentration 1.1 µg/mL
Anti-Antimicotic 1x	Gibco	15240-096
B27	Gibco	12587010
Bovine Serum Albumin	Sigma	AA3311
BSA 50 mg/mL stock solution	Sigma	A3311
CaCL2	ACROS Organiics	206791000	Component of Equine Ringer ‘s Stock 1: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2. Combine with Equine Ringer’s Stock 2 to make complete “Ringer’s Solution”.
Collagenase	Sigma	9891
DMEM-F12 media	Thermo Fisher	11320033
Donkey anti-rabbit IgG Alexa Fluor 594	Invitrogen	21207
EVOM EndOhm dual electrode TEER-measuring chamber	World Precision Instruments	EVM-EL-03-01
EVOM Manual for TEER Measurement	World Precision Instruments	EVM-MT-03-01
G5	Gibco	17503012
Gentamicin solution	Sigma	G1272	Final concentration 20 µg/mL
GFAP antibody	Abcam	4674
Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 488	Invitrogen	28175
IL-1β ELISA	Thermo Fisher	ESIL1B
KCl	Thermo Fisher	P330-500	Component of Equine Ringer’s Stock 1: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2. Combine with Equine Ringer’s Stock 2 to make complete “Ringer’s Solution”.
L-glutamine solution	Corning	25-00-Cl
Matrigel	BD Bioscience	354277
MgCl2	Thermo Fisher	M33-500	Component of Equine Ringer’s Stock 1: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2. Combine with Equine Ringer’s Stock 2 to make complete “Ringer’s Solution”.
N2	Gibco	17502048
Na2HPO4	Thermo Fisher	BP332-1	Component of Equine Ringer’s Stock 2: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2. Combine with Equine Ringer’s Stock 1 to make complete “Ringer’s Solution”.
NaCl	Thermo Fisher	S271-10	Component of Equine Ringer’s Stock 1: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2. Combine with Equine Ringer’s Stock 2 to make complete “Ringer’s Solution”.
NaH2PO4	Thermo Fisher	BP329-500	Component of Equine Ringer’s Stock 2: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2. Combine with Equine Ringer’s Stock 1 to make complete “Ringer’s Solution”.
NaHCO3	Thermo Fisher	S637-212	Component of Equine Ringer’s Stock 2: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2. Combine with Equine Ringer’s Stock 1 to make complete “Ringer’s Solution”.
Pen/Strep solution	Gemini	400-109
Poly-L-lysine	Sigma	P2636	0.5 mg/mL in 1x borate buffer
Prism software	GraphPad
Protease	Sigma	P4630
Sodium bicarbonate solution	Sigma	S8761	7.5% stock solution