Control espacio-temporal de la actividad proteica a través de la regulación alostérica optogenética

Resumen

Este protocolo describe la aplicación de un dominio de interruptor alostérico activado por luz azul (LightR) para el control espacio-temporal reversible de la actividad de las proteínas. Utilizando la tirosina quinasa Src como modelo, este estudio ofrece un protocolo elaborado para desarrollar y caracterizar Src regulado por luz (LightR-Src). Demuestra la versatilidad de este enfoque en todas las clases de enzimas.

Resumen

La optogenética ofrece el potencial de imitar el control espacio-temporal complejo de la actividad enzimática hasta una resolución subcelular. Sin embargo, la mayoría de los enfoques optogenéticos a menudo enfrentan desafíos significativos para integrar múltiples capacidades en una sola herramienta aplicable a una amplia gama de proteínas objetivo. Lograr un control preciso sobre la cinética de encendido y apagado, garantizar una fuga mínima en la oscuridad y demostrar un rendimiento eficiente en células de mamíferos con precisión subcelular son algunos de los desafíos más comunes que se enfrentan en este campo. Una solución prometedora radica en la aplicación de dominios sensibles a la luz diseñados racionalmente para controlar alostéricamente la actividad de las proteínas. Con esa estrategia, generamos un método optogenético que combina todas las características deseadas. El enfoque implica la incorporación del módulo de interruptor alostérico regulado por luz (LightR) en la proteína objetivo para regular la actividad enzimática utilizando luz azul (465 nm). El dominio LightR se genera mediante la unión de dos dominios fotorreceptores Vivid (VVD), creando una abrazadera sensible a la luz que se puede incorporar en un pequeño bucle flexible dentro del dominio catalítico de una enzima. En su estado oscuro, la pinza LightR está abierta, distorsionando así el dominio catalítico de la enzima e inactivándola. Tras la exposición a la luz azul, el dominio LightR se cierra y restaura la estructura y la actividad enzimática del dominio catalítico. En este manuscrito, discutimos estrategias de diseño para generar una proteína quinasa regulada por luz y demostramos su control por luz azul, reversibilidad, cinética y regulación precisa a nivel subcelular, lo que permite una precisión espacio-temporal ajustada. Utilizando la tirosina quinasa Src como modelo, mostramos un protocolo para regular eficazmente la actividad de la quinasa LightR-Src. También demostramos la aplicabilidad de LightR en diferentes clases de enzimas, ampliando la utilidad del sistema de herramientas para abordar cuestiones mecanicistas de las vías de señalización en diferentes enfermedades.

Introducción

La capacidad de la célula para interpretar señales externas y convertirlas en respuestas específicas en contextos fisiológicos o patológicos está dirigida por grupos específicos de proteínas. La contribución de cualquier proteína a estas respuestas complejas a menudo se define por su ubicación subcelular, nivel de expresión y el momento de la activación transitoria, sostenida u oscilatoria. Diseccionar el papel de estos parámetros individuales en la regulación de la señalización exige métodos capaces de replicar el intrincado control espacio-temporal de la actividad de las proteínas a nivel subcelular. Las técnicas tradicionales, como la manipulación genética y los inhibidores de moléculas pequeñas, se quedan cortas en este sentido. Por el contrario, las técnicas optogenéticas prometen el potencial para la disección de procesos biológicos mediante la manipulación o imitación de procesos fisiológicos y patológicos. Sin embargo, las herramientas actuales a menudo carecen de una amplia aplicabilidad o control subcelular. Varias estrategias existentes logran una regulación estricta de la localización y las interacciones de las proteínas; pero carecen de control directo sobre la actividad enzimática 1,2,3,4. Otros permiten la regulación de la actividad enzimática, pero pueden carecer de control subcelular o tener una aplicabilidad limitada en diferentes clases de enzimas 5,6,7,8,9. En este documento de protocolo, describimos un nuevo método de ingeniería de proteínas que combina las ventajas de la optogenética en una sola herramienta: regulación temporal estricta, cinética sintonizable, control subcelular y amplia aplicabilidad enzimática¹⁰. Diseñamos un dominio regulado por luz (LightR) que funciona como un interruptor alostérico cuando se inserta en la proteína objetivo de interés. Esta estrategia permite un estricto control espacio-temporal de la activación y desactivación de una proteína de interés en las células vivas.

Aquí, se discute el diseño y la estrategia de aplicación de la herramienta optogenética LightR en varias clases de enzimas. Este estudio ofrece un protocolo paso a paso para el desarrollo, caracterización y aplicación de la tirosina quinasa Src regulada por luz (LightR-Src). El estudio demuestra aún más la capacidad de ajuste de la cinética de inactivación del interruptor LightR. El interruptor LightR de inactivación lenta puede mantener la actividad enzimática con una frecuencia de iluminación reducida, mientras que la versión de ciclo rápido, FastLightR, requiere una iluminación más frecuente para la activación, pero muestra una inactivación rápida cuando la iluminación está apagada. La activación/inactivación de FastLightR-Src en células vivas induce ciclos de propagación y retracción celular. La diseminación celular inducida por FastLightR-Src coincide con el papel fisiológico de la quinasa Src^11,12. Debido a la cinética de inactivación rápida, FastLightR-Src también se puede regular a nivel subcelular, lo que resulta en la estimulación de las protuberancias locales y la polarización celular. Para demostrar la aplicabilidad de la herramienta LightR a otros tipos de enzimas, guiamos brevemente a los lectores a través de un éxito similar con la quinasa bRaf regulada por luz diseñada (LightR-bRaf, FastLightR-bRaf) y una recombinasa de ADN Cre de sitio específico (LightR-Cre). En general, este enfoque tiene el potencial de avanzar en nuestra comprensión de las complejas vías de señalización que dan forma a la fisiopatología de diversas enfermedades.

Protocolo

1. Diseño y desarrollo de LightR (Figura 1)

1. Planificación estratégica
   NOTA: El dominio LightR se compone de dos dominios fotorreceptores Vivid (VVD) conectados en tándem de Neurospora crassa^13,14,15,16. Los VVD se homodimerizan en presencia de luz, y dicha dimerización implica un cambio conformacional que hace que el extremo N-terminal de un monómero VVD coincida con el extremo C de otro monómero VVD (Figura 1A). La conexión de dos dominios VVD con un enlazador flexible crea un dominio en forma de abrazadera que se abrirá en la oscuridad y se cerrará al iluminarse con luz azul. La integración de esta pinza en el dominio catalítico de una enzima permite la regulación de la actividad mediada por la luz. En la oscuridad, la pinza abierta distorsiona el dominio, desactivando la enzima; La iluminación con la luz azul hace que la pinza se cierre, restaurando la actividad de la enzima (Figura 1B). Este concepto se puede aplicar a enzimas de varias familias, incluidas las proteínas quinasas y las recombinasas de ADN¹⁰ (Figura 1C).
   1. Diseño de LightR
      1. Para conectar dos moléculas de VVD, utilice un enlazador flexible de 22 aminoácidos (GGS)4G(GGS)3 entre cada monómero.
         NOTA: El enlazador proporciona suficiente flexibilidad y longitud para acomodar la asociación y disociación de monómeros VVD.
      2. Agregue enlazadores GPGGSGG y GSGGPG a los terminales N y C del dominio LightR, respectivamente.
         NOTA: Es posible que sea necesario ajustar la longitud y la composición de los enlazadores para una proteína específica. Los enlazadores GSG más cortos y de un solo Gly se utilizan de forma rutinaria cuando se necesita una regulación más estricta. El tamaño del bucle de inserción y su proximidad a los residuos catalíticos también influirán en el rango dinámico de la regulación. Es más probable que los bucles más cortos proporcionen una regulación más estricta de la actividad catalítica, pero pueden resultar en una menor actividad después de la iluminación. La secuencia del dominio LightR se proporciona en la Tabla complementaria 1.
   2. Inserción de LightR
      NOTA: Un sitio de inserción de LightR adecuado permitirá una regulación estricta de la función del dominio objetivo sin bloquear estéricamente sus interacciones ni causar cambios estructurales irreversibles que afecten su papel biológico. Una estructura cristalina de la proteína objetivo es una guía ideal en la identificación de tales regiones de bucle flexibles para la inserción de LightR. Si es necesario, la estructura cristalina de un homólogo cercano puede ser suficiente. A continuación se proporcionan algunos criterios generales a tener en cuenta.
      1. Asegúrese de que el bucle de inserción esté acoplado estructuralmente a los elementos catalíticos críticos de la enzima. Asegúrese de que el bucle de inserción seleccionado no sea un sitio de unión existente para la proteína y que la inserción de LightR no interrumpa potencialmente ninguna interacción funcional debido a efectos estéricos.
      2. Como estrategia inicial, reemplace un aminoácido en el bucle de inserción al insertar LightR. Diríjase al centro del bucle de inserción que contenga un aminoácido polar o pequeño (por ejemplo, Glu, Arg, Lys, Gly) expuesto al disolvente y que no participe en interacciones intramoleculares.
         NOTA: Cuando el reemplazo de un aminoácido no da como resultado una proteína funcional, la optimización de la construcción LightR requerirá el reemplazo de múltiples aminoácidos o todo el ciclo de inserción. Evalúe la funcionalidad de varios sitios de inserción para LightR dentro del bucle definido.
      3. Asegurar que la enzima diana funcione independientemente de la regulación endógena. Para ello, utilice una versión mutante constitutivamente activa de la enzima para la plantilla de inserción.
         NOTA: Las enzimas de tipo salvaje también se pueden usar para generar construcciones LightR, pero esto puede resultar en un sistema AND cerrado que estará regulado por mecanismos endógenos y luz.
      4. Los controles positivos y negativos son vitales para el análisis de la actividad de la enzima LightR. Utilice mutantes constitutivamente activos de proteínas endógenas como controles positivos y versiones mutantes catalíticamente inactivas de la enzima LightR objetivo como controles negativos.
         NOTA: Al seleccionar mutaciones inactivadoras, es crucial asegurarse de que la mutación esté lo suficientemente espaciada desde el sitio de inserción de LightR para evitar interrumpir la irreversibilidad del plegamiento de la enzima LightR. Sobre la base de los criterios anteriores, el sitio de inserción de LightR en la quinasa Src se selecciona en una región de bucle flexible que está estructuralmente acoplada al motivo GXGXXG altamente conservado en la región de bucle G/bucle rico en glicina de unión a ATP a través de una hebra beta. Es importante destacar que se coloca lejos del bolsillo de unión de ATP y de la región de unión del sustrato^10,17 (Figura 1C (i)).
         NOTA: Debido a la homología estructural entre quinasas, el sitio de inserción de LightR en bRaf se selecciona en el mismo bucle estructural que el sitio de inserción en Src (Figura 1C (ii)).
         NOTA: Sobre la base de los principios establecidos en la Sección 1.1.2., el sitio de inserción de LightR en Cre recombinasa, una no quinasa, se elige en uno de los bucles flexibles distantes del núcleo catalítico, es decir, el sitio de unión al ADN. Sin embargo, el bucle de inserción todavía está estructuralmente acoplado a los residuos catalíticos críticos dentro del dominio de unión al ADN a través de una α-hélice para garantizar el éxito de la funcionalidad de LightR-Cre (Figura 1C (iii)). Todos los sitios de inserción con controles positivos y negativos para las diferentes enzimas descritas en el protocolo actual se detallan en la Tabla Suplementaria 2.
   3. Desarrollo de FastLightR.
      NOTA: La introducción de la mutación I85V en ambos VVDs en LightR permite una dinámica de activación-inactivación más rápida, atribuida a la rápida conversión del mutante al estado oscuro^18,19. La generación de FastLightR-Src y FastLightR-bRaf con cinética de inactivación rápida permite un control temporal estricto de la activación y la inactivación. Permite lograr la regulación subcelular de LightR-Src en células vivas.
      NOTA: La actividad recombinasa de Cre da lugar a una recombinación irreversible del ADN; por lo tanto, las propiedades de reversibilidad de LightR no son aplicables.
      NOTA: Para simplificar la detección de la construcción LightR, se puede adjuntar una proteína fluorescente o cualquier otra etiqueta adecuada al extremo N o C de la proteína objetivo. En este estudio se utilizó mCherry-myc para LightR-Src, Venus para LightR-bRaf y miRFP670 para LightR-Cre recombinasa.
2. Estrategia de clonación
   NOTA: El enfoque de clonación, a diferencia de los enfoques tradicionales, se basa en la mutagénesis dirigida al sitio que no se basa en sitios de restricción específicos^10,20.
   1. Generación de un "Megaprimer"
      1. Codón - Optimice los genes LightR para garantizar la expresión estable de las dos secuencias de ADN VVD en tándem de origen fúngico en células de mamíferos y para hacer que las secuencias sean lo más diferentes posible para una clonación sin errores mediante PCR. Para realizar la optimización de codones, siga los pasos 1.2.1.2-1.2.1.3.
      2. Alinee la secuencia de aminoácidos de los VVD y los enlazadores seleccionados uno al lado del otro para crear el mapa de secuencia teórico de LightR.
      3. Pegue la secuencia en cualquier plataforma de optimización de codones en línea que utilice un algoritmo avanzado para la optimización de codones para determinar la mejor opción de secuencia con una complejidad mínima. Asegúrese de seleccionar el organismo objetivo, mantener el marco de lectura y seleccionar las secuencias VVD para la optimización.
      4. Obtenga el ADN de LightR como un fragmento sintetizado personalizado (consulte la Tabla complementaria 1) o de una construcción de LightR¹⁰ publicada anteriormente.
      5. Amplifique el gen LightR para generar "Megaprimer" utilizando la estrategia²⁰ descrita anteriormente en la Figura 1D. Sintetice el LightR "Megaprimer" mediante PCR siguiendo las recomendaciones del fabricante para la ADN polimerasa específica y utilizando la siguiente mezcla de reacción de PCR:
         5x tampón compatible con ADN polimerasa: 10 μL
         100 μM Megaprimer delantero: 0,5 μL
         100 μM Megaprimer inverso: 0,5 μL
         Mezcla dNTP de 10 nM: 2 μL
         ADN polimerasa (2000 unidades/mL): 1 μl (0,02 U/μL)
         50 ng ADN plantilla: 1 μL
         Agua de grado PCR: 35 μL
         NOTA: Aquí se utiliza la ADN polimerasa de arranque en caliente de alta fidelidad con temperaturas de recocido de cebador universales.
      6. Separar la megaimprimación resultante mediante electroforesis en gel de agarosa. El producto tendrá una longitud aproximada de 1000 nucleótidos. Extraer la megaimprimación del gel de agarosa y purificar utilizando un kit de extracción en gel, siguiendo las recomendaciones del fabricante o utilizando una técnica análoga.
   2. Inserción del gen LightR mediante mutagénesis dirigida al sitio: Inserte el LightR, reemplazando un aminoácido deseado o una longitud de aminoácidos. El plásmido de plantilla será aquel en el que se inserte el dominio LightR. Realice la reacción de PCR como se describió anteriormente²⁰ utilizando la siguiente mezcla.
      5x Tampón compatible con ADN polimerasa: 5 μL
      Mezcla dNTP de 10 nM: 1 μL
      ADN polimerasa (2000 unidades/mL): 1 μL (0,02 U/μL)
      50 ng ADN de la plantilla objetivo: 1 μL
      Megaprimer extraído (masa calculada): 10 μL
      DMSO: 2,5 μL
      Agua de grado PCR: 2,5 μL
      NOTA: Masa del megubador (ng) = relación molar deseada entre la plaquita y el vector x la masa del vector x la relación entre las longitudes del inserto y del vector. La relación molar de inserción/vector deseada utilizada es de 3/1.
   3. Una vez finalizada la reacción de PCR, añadir 1 μL de enzima DpnI (2000 unidades/mL) para digerir selectivamente sólo el exceso de ADN metilado e incubar la mezcla a 37 °C durante 1-1,5 h. Esto aumentará significativamente el rendimiento de la construcción modificada.
   4. Transformar 1-2 μL de la reacción de PCR en células competentes para DH5α siguiendo los protocolos del fabricante.
   5. Placa de bacterias transformadas en placa de caldo Luria (LB)-agar con el antibiótico adecuado para la selección. Incubar la placa a 37 °C durante la noche o a temperatura ambiente (RT; 25-30 °C) durante 72 h.
      NOTA: Las placas LB con colonias cultivadas en ellas se pueden almacenar a 4 °C hasta por 1 mes, y el protocolo se puede pausar.
   6. PCR de cribado de colonias
      1. Para el cribado de colonias basado en PCR, diseñe cebadores que se recocen en el inserto LightR y se dirijan al ADN para generar fragmentos de aproximadamente 400-700 pb.
      2. Agregue una pequeña cantidad de una colonia de la placa LB a la mezcla de PCR que se proporciona a continuación y proceda al termociclado siguiendo las recomendaciones del fabricante para la ADN polimerasa específica.
         2x Mezcla Maestra Taq RED: 5 μL
         Agua de grado PCR: 5 μL
         100 μM Imprimación directa : 0,5 μL
         100 μM Imprimación inversa: 0,5 μL
      3. Comprobación de colonias positivas mediante electroforesis en gel de agarosa.
      4. Elija las colonias que generaron el tamaño de producto de PCR deseado e inocule individualmente en 3 mL de caldo LB con el antibiótico, coincidiendo con la resistencia al antibiótico en la columna vertebral del plásmido. A continuación, incubar y agitar a 37 °C durante la noche.
      5. Extraiga el ADN plasmídico del cultivo líquido siguiendo las instrucciones del fabricante del kit de purificación de plásmidos para la extracción de ADN plasmídico y verifique la presencia del inserto mediante secuenciación.
         NOTA: Los cebadores de clonación se resumen en la Tabla Suplementaria 3.

2. Recubrimiento celular y análisis bioquímico de la actividad de la enzima LightR (Figura 2A)

1. Para el análisis bioquímico de las LightR-quinasas (LightR Src, FastLightR Src, LightR bRaf), coloque 1 x 10⁶ células LinXE por placa de cultivo celular de 3,5 cm para cada grupo experimental. Véase el cuadro complementario 4.
2. Incubar las células a 37 °C y 5 % de CO₂ durante 16-18 h.
3. Al día siguiente, transfectar las células con la construcción de ADN seleccionada, utilizando un reactivo de transfección adecuado siguiendo las recomendaciones del fabricante (Tabla suplementaria 4).
   NOTA: El reactivo de transfección óptimo dependerá de la construcción, el vector y el tipo de células utilizadas. En este estudio se utilizaron 2 μg de ADN en una placa de 3,5 cm utilizando un reactivo de transfección. Se deben realizar pruebas empíricas para determinar el reactivo de transfección óptimo. Dado que las construcciones transfectadas expresarán proteínas reguladas por luz azul, todos los pasos posteriores del manejo de células transfectadas deben realizarse bajo luz roja. Envuelva las placas con celdas transfectadas con papel de aluminio antes de colocarlas en la incubadora para evitar la iluminación accidental.
4. Después de 16-18 h de transfección, exponga las células a la luz azul¹⁰. Para realizar esto, coloque un sistema de lámpara de panel de diodo emisor de luz (LED) de 465 nm en la incubadora de cultivo de tejidos. Coloque un panel de plexiglás perforado a 10 cm por encima de la lámpara para obtener la iluminación deseada de 3 mW/^cm2 (Archivo Suplementario 1). Se necesita un panel perforado para mantener la circulación de aire ininterrumpida en la incubadora. Ilumina las celdas durante el período deseado.
5. Para la activación de LightR-Src y LightR-bRaf, utilice iluminación continua. Para una iluminación continua, encienda y apague el panel LED manualmente.
6. Para mantener el ciclo de activación/inactivación de FastLightR Src, utilice ciclos de encendido/apagado controlados manualmente o por un microcontrolador.
   NOTA: Se pueden utilizar varios kits de herramientas de software que proporcionan un entorno de desarrollo integrado (IDE) para escribir y cargar el código requerido. Estos kits de herramientas admiten la programación C/C++ y ofrecen acceso de entrada/salida de propósito general (GPIO), que es esencial para controlar la iluminación pulsada. En el Archivo Complementario 1 se describe detalladamente los protocolos y el código utilizados para estos fines.
7. Al final de los respectivos puntos de tiempo del experimento (Tabla suplementaria 4), recoja las células bajo luces rojas seguras. Aspire el medio y lave las celdas con PBS frío.
8. Para aislar la proteína, lisar las células con 500 μL de tampón de muestra Laemmli 2x suplementado con 2-Mercaptoetanol al 5% v/v. Incubar el lisado a 100 °C durante 5 min. Analizar los lisados celulares mediante electroforesis en gel de proteínas y Western blot²¹.
   NOTA: La composición de 2x tampón Laemmli es la siguiente: Para 500 mL: 5,18 g de Tris-HCL, 131,5 mL de glicerol, 52,5 mL de SDS al 20%, 0,5 g de azul de bromofenol, pH final 6,8.
9. Evaluar la actividad de LightR-Src evaluando el nivel de fosforilación de p130cas endógena en Tyr249 y paxillin en TyrY118^22,23 (Figura 2). Evaluar la actividad de LightR-bRaf evaluando el nivel de fosforilación de MEK1 en Ser217/221 y ERK1/2 en TyrY202/204^24,25.

3. Análisis funcional de la actividad de LightR-Cre

1. Para el análisis funcional de la actividad de LightR-Cre, placa 1 x 10⁶ células LinXE por placa de cultivo celular de 3,5 cm. Incubar las células a 37 °C y 5% de CO₂ durante 16-18 h.
2. Transfecte las células siguiendo el protocolo descrito en la sección 2, Figura 2A y la Tabla complementaria 5. Co-transfecta un total de 2 μg de ADN, con una proporción de 1:9 de LightR-Cre-iRFP670 y un plásmido Reporter Floxed-STOP-mCherry².
3. Después de 16-18 h después de la transfección, ilumine las células. Una activación eficiente de LightR-Cre necesita una iluminación prolongada. Por lo tanto, para evitar la fototoxicidad, utilice iluminación pulsada durante 8 h con ciclos de 2 s ON y 20 s OFF utilizando un sistema de lámpara de panel LED de 465 nm controlado por un microcontrolador como se detalla en la sección 2 y en el Archivo Suplementario 1.
4. Realice imágenes mediante microscopía de epifluorescencia con un objetivo de aire de 20x. Para la visualización de LightR-Cre-iRFP670, utilice el conjunto de filtros Cy5, y para la visualización de mCherry a partir de la expresión Floxed-mCherry, utilice el conjunto de filtros RFP.
   NOTA: Para la obtención de imágenes, se utiliza un microscopio de epifluorescencia equipado con cubos de luz Cy5/RFP.

4. Preparación de muestras para la obtención de imágenes de células vivas

1. Placa 2 x 10⁵ células HeLa por placa de cultivo de tejidos de 35 mm en medio de cultivo celular e incubar durante 2 h a 37 °C y 5% de CO₂.
2. Una vez que las células se hayan unido y la confluencia sea de aproximadamente el 60%-70%, cotransfecte las células HeLa con una de las siguientes mezclas: (i) 0,85 μg de FastLightR-Src-mCherry-myc/0,15 μg de Stargazin-iRFP, o (ii) 0,75 μg de FastLightR-bRaf-Venus/0,25 μg de mCherry-ERK2
   NOTA: En los experimentos FastLightR-Src, el Stargazin-iRFP se utiliza para etiquetar la membrana plasmática para el análisis de propagación celular. Si se desea una mayor expresión de FastLightR-Src, se puede omitir stargazin-iRFP y, en su lugar, se puede usar 1 μg de FastLightR-Src. En estos casos, se debe utilizar un tinte de membrana para visualizar las células. Las tinciones de membrana plasmática se utilizan de forma rutinaria para etiquetar las membranas celulares.
3. Cubra la placa con papel de aluminio para evitar la iluminación accidental de las células e incube durante 16-18 h a 37 °C y 5% de CO₂.
4. Complete todos los pasos siguientes bajo la iluminación de luz roja para evitar la activación inadvertida de las construcciones. La exposición a la luz blanca inducirá la activación de las LightR-quinasas y podría afectar a los resultados posteriores.
5. El mismo día, rebozar 3 cubreobjetos de vidrio redondos (25 mm de diámetro, 0,17 mm de grosor) durante la noche con 5 mg/L de fibronectina en PBS a 37 °C.
6. Enjuague los cubreobjetos con PBS 16-18 h después de la transfección y coloque ~1 x 10^{5 5} células HeLa transfectadas en cada cubreobjetos. Incubar en medios de cultivo celular durante 2 h a 37 °C y 5% de_CO2.
   NOTA: La baja densidad de siembra es necesaria para garantizar que las células en el campo de visión no se toquen entre sí.
7. Prepare los medios de imagen añadiendo FBS a los medios de imagen L-15 de Levobitz hasta una concentración final del 5%. Filtre la solución a través de un filtro de 0,22 μm y caliéntela a 37 °C.
8. Precalentar el aceite mineral a 37 °C.
9. Lave los cubreobjetos que contienen las células con PBS dos veces. Si usas un tinte para membranas, tiñe las células siguiendo las instrucciones del fabricante antes de lavar los cubreobjetos.
10. Coloque con cuidado el cubreobjetos en una cámara de imágenes de células vivas. Agregue 1 mL de medio de imagen L-15 a la cámara.
11. Agregue 1 ml de aceite mineral sobre el medio para evitar la evaporación durante el proceso de obtención de imágenes.
12. Mantenga la cámara protegida de la luz a 37 °C hasta que esté preparada para la toma de imágenes.

5. Activación global e imágenes de FastLightR-Src (Figura 3)

1. Coloque un anillo de luz LED azul para microscopía en el condensador del microscopio, colocándolo aproximadamente 1,5 cm por encima del portamuestras. Conecte el relé de control de CA/CC para el anillo de luz a la computadora del microscopio.
   NOTA: Para los experimentos de este estudio, la iluminación se controló a través de una interfaz lógica de transistor-transistor (TTL) a través del software de imágenes. La iluminación epifluorescente también se puede usar para activar globalmente las construcciones LightR si no hay una fuente de iluminación externa disponible. Las longitudes de onda de excitación GFP, como el filtro de excitación de 490/20 nm, son efectivas para activar LightR.
2. Coloque la cámara en una platina de microscopio precalentada a 37 °C y seleccione celdas que expresen FastLightR-Src-mCherry y Stargazin-iRFP (Figura 3B) o FastLightR-bRaf-Venus y mCherry ERK-2 (Figura 5B).
3. Para el estudio de experimentos de iluminación global e imágenes, utilice objetivos de alto rendimiento compatibles con microscopio (40x) con corrección apocromática, corrección de campo plano y alta apertura numérica.
   1. Para estudios basados en iluminación global de la cinasa Src, utilice filtros de excitación de 561/10 nm y de emisión de 595/40 nm para visualizar FastLightR-Src-mCherry y utilice la excitación de 640/20 nm y el filtro de emisión 655LP para visualizar stargazin-iRFP.
   2. Para estudios basados en iluminación global de la quinasa bRaf, utilice filtros de excitación de 514/10 nm y de emisión de 540/21 nm para visualizar FastLightR-bRaf-Venus y utilice filtros de excitación de 561/10 nm y de emisión de 595/40 nm para visualizar mCherry-ERK-2.
   3. Utilice un espejo policromático multibanda en todos los canales de imágenes fluorescentes.
4. Dependiendo de las condiciones experimentales, considere las siguientes recomendaciones.
   1. Tome imágenes de las células durante al menos 10 minutos antes de la iluminación para establecer una actividad basal de las células.
      NOTA: Esta línea de base es necesaria para determinar si la activación de la quinasa FastLightR por iluminación induce algún cambio en el comportamiento de la célula o en la localización de la proteína. También se pueden realizar períodos más largos de imágenes basales para proporcionar una mayor significación estadística.
   2. Debido a la rápida cinética de inactivación de FastLightRs, la inclusión de muchas células para la obtención de imágenes puede provocar la desactivación de Src/bRaf entre las posiciones de la etapa y puede atenuar su respuesta. Para evitar este error, imagine 4 células/min mientras analiza la actividad de FastLightR-Kinase en el protocolo descrito e imagine cada célula seleccionada cada minuto durante un total de 110 minutos (Archivo complementario 2).
   3. Utilice la iluminación pulsada en lugar de la iluminación continua para reducir los posibles efectos fototóxicos de la luz azul. La iluminación durante 12 s para cada una de las 4 celdas/min es efectiva (Archivo Suplementario 2, Figura 3A).
      NOTA: Los ciclos de iluminación deben determinarse empíricamente para diferentes construcciones y tipos de fuentes de iluminación.
   4. Apague la iluminación durante la obtención de imágenes celulares para evitar el sangrado en los canales fluorescentes.
      NOTA: La obtención de imágenes de demasiadas células a la vez disminuirá el tiempo total de iluminación disponible para la muestra, lo que provocará una respuesta atenuada debido a una activación insuficiente.
5. Después de la imagen, guarde las películas como un archivo . Formato de archivo de pila TIF para análisis.
   NOTA: Debido a la iluminación menos uniforme con la epifluorescencia GFP en comparación con la luz anular, los experimentos con epifluorescencia GFP requerirán una iluminación más frecuente. Esto da como resultado que se obtengan imágenes de menos células por experimento.

6. Activación subcelular e imagen de FastLightR-Src (Figura 4)

1. Coloque la cámara en una platina de microscopio precalentada a 37 °C y seleccione una sola célula que exprese tanto FastLightR-Src-mCherry como Stargazin-iRFP.
2. Seleccione las regiones específicas (ROI) dentro de la celda que desea iluminar. Este estudio elige un área pequeña en la periferia de la célula seleccionada.
   NOTA: Para la iluminación local, se utiliza un láser de 445 nm enfocado por un módulo TIRF en modo FRAP o un dispositivo de microespejo controlado a través de la interfaz TTL a través del software de imagen. Cualquier sistema de iluminación con patrones funcionará para estos experimentos. Si se utiliza un sistema basado en escaneo, determine la intensidad y la homogeneidad del láser para una activación suficiente sin dañar la célula.
3. Visualice la celda seleccionada cada minuto durante 20 minutos en el estado basal antes de la iluminación, 50 minutos mientras se ilumina localmente, luego 20 minutos después de la activación para un total de 90 minutos (Archivo complementario 2).
4. Para la activación y desactivación, proporcione una cantidad adecuada de tiempo adecuado para la proteína objetivo para permitir la desactivación completa de la proteína LightR. Para FastLightR-Src, espere al menos 10 minutos de desactivación para que la actividad residual se distrague y permita 20 minutos de desactivación en la configuración experimental demostrada para la iluminación local.
5. Después de la imagen, guarde las películas como . Formato de archivo de pila TIF para análisis.

7. Análisis de dispersión celular

1. Preparar imágenes para el procesamiento y análisis de datos. Asegúrese de que las imágenes estén en un archivo . Formato de pila TIF. Guárdelos directamente desde el software de creación de imágenes o conviértalos con un programa de código abierto.
2. Descargue el paquete de scripts CellGeo de los archivos comprimidos de datos complementarios²⁶.
   NOTA: El paquete CellGeo contiene varios scripts diferentes. Elija el paquete deseado de la lista en función del tipo de análisis, tal como se describe en las secciones 7 a 9 del protocolo.
3. Abra y ejecute el script titulado MovThresh para crear una máscara de la celda.
   1. Seleccione Archivo > Importar (.tif) y seleccione las imágenes Stargazin-iRFP de las celdas.
   2. Escanee los marcos usando la barra de desplazamiento en la esquina inferior izquierda. Si el umbral sugerido es adecuado, vaya al paso 7.4.
   3. Si el umbral sugerido no se alinea con el comportamiento de la celda, elija curvas suavizadas o personalizadas debajo de Selección de curva. Cree la curva personalizada desplazándose por los marcos y, a continuación, ajustando el umbral en el lado derecho de la ventana.
   4. Haga clic en Volver a umbral.
   5. Haga clic en Archivo > Guardar como máscaras, Cambie el nombre del archivo y guárdelo con la opción Guardar como .
4. Abra el archivo de pila recién creado en un programa de análisis de imágenes de código abierto.
5. Seleccione Imagen > ajuste > umbral > aplicar.
6. Seleccione Analizar > Analizar partículas > Comprobar los resultados de la pantalla -> Aceptar.
7. Calcule el cambio en el área de cada celda dividiendo el área en un momento dado por el área promedio de la misma celda antes de la irradiación de luz azul.
8. Traza el cambio de área como un gráfico de líneas o de barras.
9. Calcule el valor medio y los intervalos de confianza del 90% para cada punto de tiempo de todas las celdas tratadas en las mismas condiciones.

8. Análisis de la dinámica del borde de la célula

1. Prepare los archivos de pila siguiendo los pasos descritos en la sección 7 del protocolo.
2. Abra y ejecute el script titulado ProActive.
   1. Seleccione Archivo > Importar máscaras > (.tif) y seleccione la máscara creada a través del script MovThresh .
   2. Seleccione la actividad de interés en el análisis en la esquina inferior derecha (Protrusivo, Retractivo o Total).
   3. Seleccione el tipo de normalización. Normalmente, se utiliza la normalización de área para estos análisis.
   4. Seleccione el marco de referencia inicial con el control deslizante de la izquierda. El control deslizante de retraso a la derecha determinará el retraso de tiempo entre dos puntos de tiempo utilizados para medir el área ganada y perdida por la celda.
   5. Si el fotograma seleccionado y el número de retardo son aditivamente mayores que el número de fotogramas de la película, la imagen de previsualización no se mostrará. Restablezca estos valores para que sean menores que el número total de fotogramas.
3. Modifique el umbral de protuberancia o retracción marcando la casilla Curva suave en la sección Resultados . Esto promedia los umbrales en una ventana específica, lo que puede resolver problemas en los que se detectan fluctuaciones menores como actividad.
4. Seleccione Ejecutar el intervalo para calcular la actividad durante el tiempo especificado por los reguladores de fotogramas y retrasos.
5. Guarde los datos numéricos seleccionando Archivo > Guardar como > resultados (.mat) y utilícelos para determinar la actividad protrusiva o retractiva media.
6. Determine los intervalos de confianza del 90% para cada punto de tiempo.
   NOTA: Esto guardará una matriz de varios valores diferentes. El archivo de texto "Cómo utilizar ProActive" incluido con el script proporciona una descripción detallada de lo que representa cada valor y cómo se han determinado²⁶.
7. Guarde la representación visual de la actividad seleccionando Archivo > Guardar como > imágenes (.tif).

9. Análisis de desplazamiento centroide

1. Para el análisis de desplazamiento de centroide, utilice cualquier software que pueda determinar las coordenadas del centroide.
2. En el software de análisis, abra la pila de imágenes enmascaradas de la celda de interés como se describe en la sección 7 del protocolo.
3. Seleccione Medir > análisis de morfometría integrado y, a continuación, haga clic en Preferencias > Dibujar marca de centroide > Comprobar y, a continuación, seleccione Medir.
   1. Registre las coordenadas del centroide antes del movimiento (A).
   2. Registre las coordenadas del centroide al final del experimento (B).
   3. Registre las coordenadas del centro del patrón de iluminación (C).
4. Ahora que se han recogido los tres puntos, determine el ángulo BAC⁸. θ₁ corresponde al ángulo ABC y θ₂ corresponde al ángulo CBA (Figura 4Cii). Para ello, utilice la siguiente ecuación:
   cosθ = cos(θ₁ - θ₂) = cosθ₁cosθ₂ + sinθ₁sinθ₂
   NOTA: Se puede utilizar una calculadora para determinar los ángulos y las distancias directamente desde las coordenadas para facilitar su uso.
5. Determine el desplazamiento del centroide multiplicando la distancia que recorrió el centroide de celda en píxeles por el factor de conversión, donde 1 píxel es igual a 0,4 μm. La conversión específica de píxeles a distancia dependerá de la ampliación y la configuración de la cámara en el sistema.
6. Una vez que se hayan determinado el ángulo de desplazamiento del centroide y la distancia, abra un software de gráficos capaz de producir imágenes de coordenadas polares.
7. Inserte el ángulo de desplazamiento del centroide como la medición θ y la distancia recorrida como el radio. Utilice el ANOVA para probar intervalos de confianza del 95%.
8. Traza los resultados y guarda la imagen.

Resultados

El LightR-Src se diseña y genera siguiendo la estrategia descrita en la Figura 1A,B. El análisis bioquímico de LightR-Src accede a la fosforilación de sustratos endógenos conocidos de Src, p130Cas (Y249)²² y paxilina (Y118)²³ en respuesta a la luz azul a 60 min de iluminación continua (Figura 2B). En particular, no se observa una activación de fondo de la ci...

Discusión

Nuestro estudio presenta un enfoque optogenético para la investigación de diversas vías de señalización y demuestra su amplia aplicabilidad en el abordaje de diferentes cuestiones biológicas. El sistema de herramientas LightR proporciona varias ventajas esenciales: (1) Regulación alostérica de la actividad de las proteínas, (2) Control temporal estricto de la actividad que se puede ajustar para lograr diferentes cinéticas de activación e inactivación, (3) Resolución espacial...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
#1.5 Glass Coverslips 25 mm Round	Warner Instruments	64-0715
1.5 mL Tubes	USA Scientific	cc7682-3394
2x Laemmli Buffer			For 500 mL: 5.18 g of  Tris-HCL, 131.5 mL of glycerol, 52.5 mL of 20% SDS, 0.5 g of bromophenol blue, final pH 6.8
4-20% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel	Biorad	4561096
5x Phusion Plus Buffer	Thermo Scientific	F538L
60 LED Microscope Ring Light	Boli Optics	ML46241324	Blue LED, 60 mm diameter, 5 W
Agarose	GoldBiotech	A-201
Anti-Erk 1/2 Antibody	Cell Signaling	9102
Anti-GAPDH Antibody	invitrogen	AM4300
Anti-GFP	Clontech	632380
Anti-mCherry Antibody	invitrogen	M11217
Anti-MEK	Cell Signaling	9122
Anti-p130Cas	BD Biosciences	610271
Anti-paxillin	Cell Signaling	2542
Anti-phospho-Erk 1/2 T202/Y204 Antibody	Cell Signaling	9101
Anti-phospho-pY249 p130Cas	Cell Signaling	4014
Anti-phospho-Y118 Paxillin	Cell Signaling	2541
Anto-phospho-S217/221 MEK	Cell Signaling	9121
Arduino Compatable Power Supply	Corporate Computer	LJH -186
Arduino Uno Rev3	Arduino	‎A000066
Attofluor Cell Chamber	invitrogen	A7816
Benchmark Fetal Bovine Serum (FBS)	Gemini Bio-products	100-106	Heat Inactivated Triple 0.1 µm sterile-filtered
bRaf-V600E-Venus			Gift from Dr. John O'Bryan, MUSC
BSA	GoldBiotech	A-420
Carbenicillin (Disodium)	Gold Biotechnology	C-103-25
CellMask Deep Red plasma membrane dye	invitrogen	c10046
Colony Screen MasterMix	Genesee	42-138
DH5a competent cells	NEB	C2987H
DMEM	Corning	15-013-CV
DNA Ladder	GoldBio	D010-500
dNTPs	NEB	N04475
Dpn1 Enzyme	NEB	R01765
DTT	GoldBio	DTT10	DL-Dithiothreitol, Cleland's Reagents
EGTA	Acros	409910250
FastLightR-bRaf-mVenus	Addgene	#162155
Fibronectin from bovine plasma	Sigma	F1141
FuGENE(R) 6 Transfection Reagent	Promega	E2692	Transfection reagent
Gel Green Nucleic Acid Stain	GoldBio	G-740-500
Gel Loading Dye Purple 6x	NEB	B7024A
GeneJET Gel extraction Kit	Thermo Scientific	K0692	Gel Extraction Kit
GeneJET Plasmid Miniprep Kit	Thermo Scientific	K0502
Glutamax	Gibco	35050-061	GlutaMAX-l (100x) 100 mL
HEK 293T Cells	ATCC	CRL-11268
HeLa Cells	ATCC	CRM-CCL-2
HEPES	Fischer	BP310-500
Iot Relay	Digital Loggers	DLI 705020645490	AC/DC control relay for illumination
Kanamycin Monosulfate	Gold Biotechnology	K-120-25
KCl	Sigma	P-4504
L-15 1x	Corning	10-045-CV
LB Agar	Fisher	BP1425-2
LED Grow Light System	HQRP	884667106091218	LED panel lamp system
LightR-bRaf-mVenus	Addgene	#162154
LightR-iCre-miRFP670	Addgene	#162158
MATLAB	Mathworks	R2024a	Software for running CellGEO Scripts
Metamorph	Molecular Devices		Imaging Analysis Software
MgCl2	Fisher Chemical	M33-500
Mineral Oil	Sigma	M5310
MiniPrep Kit	Gene Choice	96-308
Mini-PROTEAN TGX Precast Gels 12 well	Bio-Rad	4561085
Molecular Biology Grade Water	Corning	46-000-CV
Multiband Polychroic Mirror	89903BS	Chroma
NaCl	Fisher Chemical	S271-3
PBS w/o Ca and Mg	Corning	21-031-CV
pCAG-iCre	Addgene	#89573
pcDNA3.1_Floxed-STOP mCherry	Addgene	#122963
pCEFL-ERK2			Gift from Dr. Channing Der's Lab, UNC
PCR Tubes	labForce	1149Z65	0.2 mL 8-Strip Tubes and Caps, Rigid Strip Individually Attached Dome Caps
Phusion Plus DNA Polymerase	Thermo Scientific	F630S
pmiRFP670-N1	Addgene	#79987
Polygon 400 Patterned Illuminator	Mightex	DSI-G-00C
Primers	IDT
PVDF Membranes	BioRad	1620219	Immun-Blot PVDF/Filter Paper Sandwiches
T0.25% Trypsin, 2.21 mM, eDTA, 1x [-] sodium	Corning	25-053-CI
Tris-Acetate-EDTA (TAE) 50x	Fischer	BP1332-1	For electrophoresis
UPlanSApo 40x Microscope Objective	Olympus	1-U2B828
USB TTL Box	National Instruments	6501	For TTL interface
β-Mercaptoethanol	Fisher Chemical	O3446I-100