Ablación de osteoblastos mediada por láser de dos fotones en larvas de pez cebra en desarrollo

Resumen

Este protocolo describe un enfoque de ablación con láser de dos fotones llevado a cabo en larvas de pez cebra, que sirve como modelo para estudiar la regeneración ósea y los efectos de la respuesta inmune a la ablación.

Resumen

El pez cebra (Danio rerio) tiene una capacidad sobresaliente para regenerar diferentes órganos y apéndices. La regeneración ósea en el pez cebra se ha estudiado utilizando diferentes métodos, como la amputación de aletas, el desplume de escamas, la trepanación del cráneo y los enfoques microscópicos. Utilizando una configuración de escaneo láser confocal equipada con un láser de dos fotones, se desarrolló un método de ablación láser como paradigma de lesión para extirpar células formadoras de hueso (osteoblastos) en el opérculo en desarrollo de larvas de pez cebra. El método descrito aquí permite la ablación de células de manera precisa, ya que el área, la forma y la profundidad se pueden ajustar con precisión. Además, este método permite obtener imágenes de la zona antes y justo después de la ablación, de modo que se pueden analizar los efectos a corto plazo de la lesión. En este montaje experimental, se estudió la respuesta inmunitaria tras la ablación de osteoblastos en la zona lesionada. Se observó un aumento en el reclutamiento de macrófagos después de la ablación, lo que indica la relevancia de su presencia durante la regeneración ósea.

Introducción

El pez cebra regenera diversos órganos como la retina, el cerebro, el corazón y el páncreas^. Además, el pez cebra regenera elementos esqueléticos, por lo que se ha utilizado para estudiar la regeneración de aletas, escamas y calvarias (casquetes craneales)². Se han utilizado diferentes paradigmas experimentales para estudiar la regeneración tisular y ósea, como la resección (amputación) de aletas, la fractura de aletas, la trepanación de cráneo ^3,4, la criolesión ^5,6 o la....

Protocolo

El protocolo de estudio recibió la aprobación de la Landesdirektion Sachsen, permisos números 25-5131/564/2, DD25-5131/450/4, 25-5131/496/56, DD25.1-5131/354/87. Las cepas de pez cebra utilizadas se mantuvieron de acuerdo con la legislación nacional y en condiciones estandarizadas como se describió anteriormente^27,28. Los detalles de todos los reactivos y el equipo utilizado en el estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Preparación de materiales y soluciones

1. Mantener los embriones en 1x medio E3.....

Discusión

La ablación láser se ha aplicado en diversas disciplinas de la investigación biológica. En particular, ha sido útil como método para estudiar la regeneración de tejidos 10,11,12. Por ejemplo, el reclutamiento y los cambios fenotípicos de las células inmunitarias innatas se analizaron recientemente a lo largo del tiempo utilizando ensayos de ablación con láser UV o láser de dos fotone.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Calcium chloride dihydrate, CaCl2·H2O	Carl Roth	5239.1
Cell Culture Dish, PS, 100/20 mm	Greiner Bio-one	664160
Dumont #55 Foceps	FST	11295-51	Tip shape straight, 11 cm, 0.05 x 0.02 mm
Falcon 6-well plate	Corning	353502
Glass-bottom microwell dish	MatTek	P35G-1.5-14-C	35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 14 mm Glass Diameter, Uncoated
Insight X3 multiphoton laser	Spectra-Physics
Leica Application Suite	LAS X, Leica Microsystems
Low melting agarose	Biozyme	840101	Biozym Plaque Agarose
Magnesium sulfate heptahydrate, MgSO4·7H2O	Sigma-Aldrich	M5921
Mating cages			many varieties, e.g. Tecniplast
Methyleneblue	Carl Roth	A514.1
MS-222	SIGMA Aldrich	A5040
Potassium Chloride, KCl	PanReac AppliChem	131494
Sodium chloride, NaCl	Carl Roth	3957.1
SP8 FALCON	Leica Microsystems		Equipped with a Insight X3 multiphoton laser and Leica Application Suite software
Stainless Steel Dissect Needle	Bochem	12010	140 mm
Stereo Microscope System SZX16	Olympus		Equipped with a LED illumination base SZX2-ILLTQ
Thermostatic Cabinets TS - WTW	xylem	TS 608/2-i	For incubation (embryo)
Transfer pipette, 3.5 mL	SARSTEDT	861171	155 x 15 mm, LD-PE, transparent
Zeiss SteREO Discovery.V12 version 4.7.1.0.	Zeiss		Equipped with Axiocam MRm camera and AxioVision sofware