Procedimientos de entrenamiento conductual para la realidad virtual fija en la cabeza en ratones

Resumen

El artículo describe los procedimientos experimentales para el paradigma de realidad virtual (VR) de pista lineal comúnmente utilizado en ratones, así como la determinación de la viabilidad de ejecutar tareas complejas de VR mediante la prueba de una tarea de discriminación de señal en forma de Y.

Resumen

La realidad virtual (RV) combinada con la fijación de la cabeza se utiliza cada vez más en los estudios de neurociencia del comportamiento, ya que permite realizar ensayos conductuales complejos en ratones con la cabeza fijada. Esto permite registros de comportamiento precisos al tiempo que incorpora varias técnicas neurofisiológicas que requieren la fijación de la cabeza para minimizar el ruido de la señal relacionado con el movimiento durante las grabaciones neuronales. Sin embargo, a pesar del creciente uso de la realidad virtual, hay pocos datos publicados sobre la metodología detallada de cómo implementarla. En este estudio, se desarrolla un protocolo de entrenamiento mediante el cual se entrena a ratones macho y hembra C57B16/J para correr por un corredor lineal virtual, cuya longitud se incrementa de 1 a 3 m en múltiples sesiones de entrenamiento. Sobre esta base, este estudio investigó la viabilidad de que los ratones realizaran comportamientos complejos dentro de la realidad virtual utilizando un paradigma de laberinto en Y. La tarea requería navegar hasta el brazo con paredes negras desde el punto de elección en el laberinto en Y. Después de alcanzar un criterio de dos días consecutivos igual o superior al 70% de aciertos, los ratones progresaron a una discriminación sensorial cada vez más difícil. Los hallazgos proporcionan detalles importantes sobre las metodologías útiles para el entrenamiento exitoso de ratones en realidad virtual y demuestran que los ratones exhiben capacidades de aprendizaje al navegar por el laberinto en Y. La metodología presentada no solo ofrece información sobre la duración del entrenamiento en ensayos basados en realidad virtual, sino que también subraya el potencial para sondear comportamientos intrincados en ratones, abriendo vías para investigaciones neurocientíficas más completas.

Introducción

Las tareas de realidad virtual se han convertido en un poderoso método de evaluación del comportamiento en ratones debido a la fijación de la cabeza, lo que permite una estabilidad mecánica que se vería comprometida en ratones que se comportan^libremente. Este método permite reducir los artefactos de movimiento en los registros electrofisiológicos ^2,3 y en las imágenes ópticas ^4,5,6,7. También facilita comportamientos repetibles⁸ y un seguimiento ocular preciso⁹. En la configuración experimental, el mouse se fija en su lugar y se coloca encima de una cinta de correr esférica con soporte de aire. Este aparato permite la exploración intrincada del comportamiento guiado visualmente dentro del entorno de realidad virtual. A medida que el ratón se mueve en la cinta de correr, su locomoción se sincroniza a la perfección con su navegación dentro del paisaje virtual, que se representa visualmente en la pantalla que rodea al ratón.

El objetivo de este estudio es doble: abordar los desafíos clave dentro de la neurociencia experimental del comportamiento y contribuir al avance de las metodologías en este campo. En primer lugar, a pesar del aumento del uso de la RV en la investigación académica 10,11,12, sigue habiendo una notable ausencia de metodologías integrales y protocolos de formación, lo que dificulta la adopción de esta tecnología por parte de nuevos investigadores. El objetivo principal fue llenar este vacío mediante la delineación de un régimen de entrenamiento detallado para el paradigma de la pista lineal, como se describe en estudios previos 13,14,15. Se utiliza un sistema disponible comercialmente para describir estos procedimientos operativos. Como descargo de responsabilidad, estas pautas de procedimiento tienen componentes específicos para este sistema; Sin embargo, para una discusión de la generalizabilidad de este protocolo, consulte la discusión. El objetivo fue describir los procedimientos conductuales, la línea de tiempo típica para realizar estos procedimientos y la tasa de éxito para entrenar ratones para correr en una pista lineal simple.

En segundo lugar, sigue habiendo una falta de documentación sobre la implementación de tareas complejas de laberintos dentro de este paradigma en ratones. Se han desarrollado ensayos virtuales complejos en ratas¹¹. Sin embargo, los ratones tienen una agudeza visual reducida en comparación con¹⁶ y a menudo se desempeñan peor en tareas complejas¹⁷. Si bien algunas investigaciones se han centrado en tareas específicas como la acumulación de pruebas o la novedad espacial¹⁸, aquí se centró en dilucidar las metodologías de entrenamiento necesarias para que los ratones participen en paradigmas de toma de decisiones dentro de entornos de realidad virtual. Para abordar este desafío, se ideó una tarea de discriminación de señales en la que los ratones tenían la tarea única de aprender a asociar el color/luminancia (negro frente a blanco) del brazo recompensado con la recompensa, lograda seleccionando el brazo negro en el punto de elección del laberinto en Y, con el brazo correcto asignado al azar en cada prueba. Esta tarea fue diseñada para requerir interacción con las señales virtuales y proporcionar información sobre las habilidades de discriminación perceptiva de los ratones.

En resumen, este estudio aborda las brechas críticas en el campo de la neurociencia conductual experimental al proporcionar protocolos de entrenamiento integrales para el uso de paradigmas de realidad virtual en ratones y dilucidar metodologías para tareas complejas de toma de decisiones dentro de este marco. Al aprovechar los conocimientos de investigaciones anteriores y diseños experimentales innovadores, este estudio tiene como objetivo agilizar las prácticas de investigación y avanzar en la comprensión de los mecanismos neuronales que subyacen al comportamiento. En las siguientes secciones se profundizará en los procedimientos experimentales y los resultados, y se discutirán los hallazgos.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran animales se llevaron a cabo en estricto apego a los protocolos establecidos por el Comité de Cuidado y Uso de Animales del NIEHS, asegurando el cumplimiento de las normas éticas y las pautas de bienestar. Para el estudio se utilizaron ratones C57BL/6Tac, de aproximadamente 8 semanas de edad.

1. Cirugía para la implantación de la barra de cabeza

1. Preparación para la cirugía
   1. Obtener la cantidad deseada de ratones para la cohorte, idealmente alojándolos individualmente para minimizar la interferencia con el implante de la barra de cabeza, aunque esto es opcional¹⁹. Este estudio utilizó un tamaño de muestra de tres ratones machos y tres hembras (inicialmente equilibrados, pero un macho fue excluido al principio del entrenamiento después de no poder correr con la pelota)
   2. Adquirir los materiales especificados en la Tabla de Materiales, ajustándolos de acuerdo con las especificidades del diseño del estudio.
   3. Una vez adquiridos los ratones, designe identificadores individuales y aplique tatuajes en la cola o perforaciones en las orejas para garantizar una identificación inequívoca. Establecer un registro exhaustivo para registrar sistemáticamente sus pesos según sea necesario para el procedimiento de restricción de agua.
2. Administración de anestesia
   1. Asegúrese de que todos los instrumentos quirúrgicos estén disponibles, incluidas las jeringas adecuadas, una almohadilla térmica, artículos metálicos (como pinzas, microtijeras y hemostáticos), solución de yodo, lubricante ocular y vasos de precipitados para solución salina y peróxido de hidrógeno. Para garantizar condiciones estériles, desinfecte todo el equipo quirúrgico y esterilice todas las herramientas quirúrgicas con un autoclave.
   2. Antes de proceder con la cirugía, realice mediciones precisas del peso de los ratones y active la almohadilla térmica a 34 °C. Registre toda la información necesaria en el cuaderno de laboratorio/quirúrgico de la institución. Verificar la adecuación de los niveles de los tanques de oxígeno e isoflurano y confirmar la disponibilidad de todos los materiales esenciales para facilitar los procedimientos quirúrgicos ininterrumpidos.
   3. Frote el ratón y colóquelo en una nariz conectada a un vaporizador diseñado para animales pequeños que recibe un 4% de isoflurano y un caudal de oxígeno de 3 L/min para inducir la anestesia. Use un carroñero para capturar cualquier gas residual potencialmente dañino (recomendado).
   4. Administre la pomada veterinaria oftálmica de petróleo en los ojos del ratón mientras está debajo de la nariz para prevenir la sequedad ocular. Aplique una sola gota en cada ojo inicialmente y vuelva a aplicar según sea necesario. Asegurar una protección constante de los ojos manteniendo siempre una capa de este lubricante con controles periódicos.
   5. Prepare el sitio quirúrgico (Figura 1A) en la cabeza del ratón afeitando el área donde el cráneo se fijará a la barra de la cabeza.
   6. Coloque los incisivos del ratón dentro del aparato estereotáxico debajo del cono de la nariz, ajustando el caudal de oxígeno a 1 L/min y administrando isoflurano al 1%-2% desde el vaporizador. Asegure el flujo adecuado de anestesia ajustando las válvulas y cambiando entre la nariz de inducción y el aparato estereotáxico en consecuencia. Extiende la pata trasera del ratón y aplica una presión firme en el dedo del pie. Si el pie no muestra una respuesta reflexiva de retirada, esto indica que la anestesia es efectiva. Repita cada 15 minutos, junto con una prueba de respiración.
   7. Asegure la cabeza del ratón en su lugar colocando barras de estabilidad quirúrgica dentro de sus canales auditivos, minimizando cualquier posible movimiento de la cabeza durante la cirugía.
   8. Antes de hacer incisiones o inyecciones, esterilice el área quirúrgica afeitada en la parte superior de la cabeza frotándola con un hisopo humedecido en un antiséptico de yodo. A partir de esta etapa, emplee guantes estériles para mantener las condiciones asépticas.
3. Administración de inyecciones
   1. Por vía subcutánea, inyecte 0,05 ml de bupivacaína (analgesia local) con una aguja de 25 G en el sitio de la incisión quirúrgica en el cuero cabelludo.
   2. Por vía subcutánea, inyecte 1 ml de solución salina (hidratación) con una aguja de 25 G en un lado de la región interescapular.
   3. Por vía subcutánea, inyecte 0,05 ml de buprenorfina (analgesia de cuerpo entero) con una aguja de 25G en el lado opuesto de la región interescapular.
4. Exponer el cráneo
   1. Utilice microtijeras para crear una incisión de la piel por encima de las suturas interfrontales e internasales del cráneo, comenzando justo por encima de la cresta de la ceja y extendiéndose hasta detrás de la escotadura occipital (Figura 1A).
   2. Use hemostáticos para sujetar los colgajos izquierdo y derecho de la piel, exponiendo el cráneo.
   3. Use un hisopo de algodón seco para eliminar el tejido conectivo del cuero cabelludo entre los pliegues de la piel sujetos.
   4. Use un hisopo de algodón humedecido (pero no saturado) con peróxido de hidrógeno para frotar el cuero cabelludo, asegurando la visibilidad de las suturas y teniendo cuidado de que el peróxido de hidrógeno no caiga en el tejido circundante.
   5. Repita los pasos 1.4.3 y 1.4.4, 2x-3x, hasta que tanto el bregma como el lambda sean claramente visibles y el cuero cabelludo se limpie a fondo.
5. Implantación de tornillos quirúrgicos
   1. Fije dos tornillos al cráneo, colocando un tornillo posterior al bregma y el otro anterior a la lambda (Figura 1B) para maximizar el área de superficie para el adhesivo dental y aumentar la estabilidad de la barra de cabeza. Coloque la ubicación de los tornillos en los objetivos a una distancia especificada de bregma. Asegúrese de que un tornillo esté colocado a la izquierda y el otro a la derecha (es decir, Antero-Posterior (AP) +1.00, Medial-Lateral (ML) -1.00 y AP -3.00, ML +3.00), asegurándose de que haya suficiente espacio entre los tornillos para acomodar la ubicación de la barra de cabeza y ajustar las coordenadas y necesarias.
   2. Perfore las posiciones del objetivo, asegurándose de que la perforación se limite al hueso del cráneo y no penetre en el tejido cerebral.
   3. Con un destornillador, atornille aproximadamente la mitad del tornillo en su lugar. Repita para el segundo tornillo.
6. Fijación del implante de la barra de cabeza
   1. Mezclar el cemento dental y administrarlo en la parte inferior de la barra de cabeza, centrándose en la superficie cóncava, y aplicar a lo largo de la sutura interfrontal del cráneo.
   2. Coloque la barra de cabeza sobre la sutura interfrontal para facilitar la unión entre el cemento dental de la barra de cabeza y el de la sutura. Sujételo firmemente en su lugar con la mano en el ángulo deseado durante aproximadamente 5 minutos hasta que se asiente. Aplique cemento dental adicional según sea necesario. (Figura 1C-E)
7. Volver a colocar la piel sobre la barra de la cabeza
   1. Suelte los hemostáticos y utilice pinzas para volver a unir los dos colgajos de piel sobre la barra de cabeza fijada con cemento dental seco. Utilice adhesivo de tejido tópico para asegurar delicadamente la piel adhiriendo lentamente las partes izquierda y derecha del cuero cabelludo juntas sobre la barra de la cabeza, comenzando desde el sitio de la incisión anterior y terminando en el sitio de la incisión posterior.
   2. Deje que el adhesivo del tejido tópico se endurezca para confirmar que el área quirúrgica se ha vuelto a sellar antes de liberar al ratón de las barras de estabilidad quirúrgica y el cono nasal.
   3. Transfiera el mouse a una jaula individual y colóquelo sobre una almohadilla térmica a 37,5 ° C.
   4. Vigile cuidadosamente al ratón para detectar cualquier signo de malestar o irregularidades en la respiración hasta que haya recuperado la conciencia. No deje al ratón desatendido hasta que haya recuperado la decúbito esternal, muestre alerta y sea ambulatorio.
   5. Después de los procedimientos quirúrgicos, permita que los ratones se sometan a un período de descanso de 1 semana. Monitoree a los ratones diariamente para detectar y abordar cualquier fluctuación notable en el peso. Proporcione puré a los ratones 3 días después de la cirugía para ayudar en la recuperación. Para evitar interferencias con la barra de cabeza, aloje estos ratones individualmente.

2. Restricción de líquidos

NOTA: La restricción de agua induce un estado de sed en los ratones, lo que aumenta su motivación para las recompensas líquidas. Sin embargo, es necesaria una implementación meticulosa para garantizar la preservación del bienestar de los ratones²⁰.

1. A la semana siguiente del día de la cirugía, establezca los pesos de referencia para los ratones.
2. Pegue un segmento de una placa de Petri pequeña (60 mm x 15 mm) con el lado cóncavo hacia abajo en el piso de la jaula, pegando una placa de Petri más pequeña (35 mm x 10 mm) cóncava hasta el centro de la superficie plana de la placa de Petri pegada al piso, con otra placa de Petri pequeña (60 mm x 15 mm) cóncava pegada con cinta adhesiva sobre la superficie plana del plato central para que sirva como depósito de agua (Figura 2).
3. Asegúrese de que la altura del plato superior evite la contaminación del material de cama y, al mismo tiempo, permita que los ratones tengan fácil acceso al agua. Añada el volumen diario de agua suministrado al depósito con una pipeta.
4. El día 1, proporcione a los ratones una dosis de 15 ml de agua por cada 100 g de masa corporal.
5. El día 2, proporcione a los ratones una dosis de 10 ml de agua por cada 100 g de masa corporal.
6. El día 3, proporcione a los ratones una dosis de 5 ml de agua por cada 100 g de masa corporal. Los ratones deben recibir una ingesta mínima de 1 ml de agua al día durante todo el estudio, independientemente de su peso corporal.
   NOTA: Los investigadores pueden optar por administrar el volumen mínimo de manera uniforme en todos los sujetos, aunque dichos ajustes deben realizarse con una cuidadosa consideración.
7. Mantenga una dosis constante durante todo el estudio de la asignación de agua a 5 mL por cada 100 g de peso corporal (o una asignación uniforme de agua de 1 mL si se prefiere)
   NOTA: Los ratones deben tener acceso ad libitum al agua durante 1-2 días a la semana cuando los ratones no estén realizando un experimento de realidad virtual (es decir, durante el fin de semana). Esto facilitará el restablecimiento de sus niveles naturales de hidratación. En los casos en que los ratones caigan por debajo del 90% de su peso inicial registrado, se les debe hacer la transición al acceso al agua ad libitum hasta que alcancen el 90% de su peso inicial. Los ratones que caen por debajo del 80% de sus pesos de referencia registrados deben ser sacrificados éticamente.
8. Retrasar la administración de su dosis diaria de agua al menos 30 minutos después de la evaluación conductual para mitigar la posible interferencia con sus comportamientos naturales de sed, esenciales para realizar el experimento con precisión.
   NOTA: Proporcionar recompensas líquidas inmediatamente después de una prueba puede influir inadvertidamente en el rendimiento de los ratones, ya que pueden anticipar recibir una recompensa inmediata, lo que podría comprometer la participación en la tarea. Por lo tanto, retrasar el acceso al agua después de la prueba evita la habituación a la entrega inmediata de recompensas y preserva la integridad de la configuración experimental.

3. Configuración del sistema

1. Familiarización con el equipo: Para conocer los componentes de hardware y otras consideraciones de los sistemas de comportamiento de realidad virtual, consulte los pasos a continuación.
   Consulte la sección de discusión para un examen de la generalización del protocolo a configuraciones de sistema comparables.
   1. Pantalla virtual o cúpula totalmente inmersiva: Esta pantalla virtual proporciona una inmersión completa para un animal dentro de un entorno virtual personalizable. El movimiento dentro del entorno virtual se sincroniza con el movimiento en la cinta de correr esférica.
   2. Sistema de recompensa líquida: El sistema de recompensa líquida funciona mediante la entrega de refuerzo líquido (agua o agua azucarada) mediante una bomba peristáltica, que dirige la solución de recompensa a través de un tubo metálico recubierto de plástico que se extiende hasta el ratón cuando una tarea se ejecuta con éxito. Contiene sensores que controlan la cantidad de recompensas obtenidas por un ratón durante una prueba.
      1. Limpie el tubo de recompensa semanalmente con alcohol etílico o un agente de limpieza alternativo. Para hacer esto, enjuague de 2 a 5 ml del agente de limpieza a través del tubo, de manera similar a la entrega de recompensa líquida, seguido de un lavado comparable con un volumen igual de agua.
      2. Al iniciar el experimento, determine la tasa de dispensación de la recompensa líquida del tubo de recompensa activándolo durante un tiempo específico y midiendo el volumen de líquido dispensado. Este procedimiento permite determinar la tasa de suministro de líquido de la bomba peristáltica. En esta investigación, se utilizó una tasa de dispensación de aproximadamente 0,0083 mL/s.
         NOTA: La mayoría de los sistemas ofrecen configuraciones programables para la duración entre la ejecución del comportamiento y la liberación de recompensas, lo que permite una planificación precisa del protocolo de estudio en función del volumen de recompensas previsto por prueba. Se determinó que la cantidad utilizada era suficiente, ya que permitía el tiempo adecuado para que el ratón consumiera la recompensa, y su volumen parecía ser motivador.
      3. Algunos protocolos pueden requerir que el ratón lama la boquilla de recompensa para iniciar la entrega de recompensas. Para el tipo de tareas empleadas aquí, esta funcionalidad no se empleó, ya que ofrece recompensas que dependen únicamente de la ejecución exitosa del comportamiento deseado (es decir, elegir el brazo correcto en el laberinto en Y). Esto ayuda a evitar fallos al principio del entrenamiento en los que la tendencia a lamer no se ha establecido lo suficiente y es menos probable que ocurra el lamido inicial. También puede permitir la medición de la expectativa de recompensa, que es disociable del rendimiento de la navegación en algunas condiciones¹¹.
      4. Mientras que algunos experimentos que utilizan la restricción de líquidos optan por el uso de agua estándar a través del tubo de recompensa, aquí utilizan agua azucarada (10% de sacarosa v/v) como estímulo motivacional adicional dentro del paradigma operante. En particular, se observó un mejor rendimiento en múltiples cohortes experimentales con la introducción de agua azucarada.
   3. Pelota de espuma de poliestireno: Esta pelota actúa como una cinta de correr esférica. Cuando están amortiguados con aire desde abajo, entrena a los ratones para que corran o caminen cómodamente sobre la pelota. Colóquelo encima de un soporte de bolas equipado con sensores de seguimiento de movimiento que recopilan datos sobre la distancia y la velocidad.
   4. Soporte para la cabeza: Coloque el aparato detrás del ratón, asegurando la alineación visual con la pantalla VR al conectar la barra de la cabeza al soporte. Este aparato es crucial para mantener el ratón en una posición fija para la cabeza, mitigando así los artefactos de movimiento, especialmente cuando el sistema se utiliza junto con técnicas de imagen óptica o electrofisiológicas.
   5. Herrajes de flujo de aire: Configure el flujo de aire desde una fuente de aire comprimido hasta la pelota para la creación de un entorno ingrávido propicio para que los ratones corran sobre la pelota. Esta configuración requiere un regulador de flujo para garantizar un control preciso sobre la presión de aire aplicada a la bola. La bola funciona de manera eficiente dentro del entorno de ingravidez con un suministro de aire mínimo. Por lo tanto, durante la configuración del sistema, determine la cantidad mínima de aire necesaria para facilitar el movimiento suave y sin obstáculos de la bola dentro del soporte. Se recomienda un caudal entre 10-20 L/min.
2. Configuración del software: Para obtener detalles específicos sobre el funcionamiento del sistema, consulte a continuación.
   NOTA: Al igual que el diseño de videojuegos²¹, la arquitectura de los mundos virtuales integra elementos clave como un controlador externo, un entorno navegable programable y un archivo de programación que contiene un diagrama de estado que delinea las funciones dinámicas. Estos componentes convergen sinérgicamente para crear una experiencia interactiva cohesiva para los sujetos que participan en estudios de investigación. La eficacia operativa del software depende de la organización precisa de los archivos dentro de las carpetas designadas. Esta explicación describirá los pasos principales necesarios para completar plantillas prefabricadas, lo que permite ajustes fáciles en los archivos existentes y guardarlos como nuevas versiones. Estas nuevas versiones constituirán la base del estudio.
   1. Utilice los tres archivos siguientes juntos para configurar un entorno virtual operativo.
      1. Archivos XML: Este formato de archivo proporciona a los usuarios la capacidad de manipular la textura de la foto de varios elementos, como el cielo, el suelo y las paredes. Coloque los archivos utilizados para las imágenes en la subcarpeta Datos de la carpeta VR. Con ellos, especifique las dimensiones del laberinto y determine la posición inicial del ratón dentro del laberinto. Defina objetos 3D (señales visuales) en ciertos nodos dentro del laberinto utilizando estos archivos. Modifique estos archivos con un editor de texto.
      2. Archivos XLSX: funcionan como los archivos de comandos que configuran los tres tipos de archivo (XML, XLSX y XAML) juntos para formar una presentación virtual cohesiva e interactiva. Utilice estos archivos para definir las rutinas experimentales que ejecutan la VR y sus accesorios, como la sensibilidad de ganancia, los datos que se extraen y los archivos que se agrupan para un experimento.
      3. Archivos XAML: La aplicación de software proporciona una interfaz gráfica para la creación de programaciones experimentales mediante la utilización de diagramas de flujo. Facilita la definición de los parámetros temporales para la prueba, los controles para la teletransportación una vez completada la prueba y el tiempo de activación para las salidas digitales dentro del marco de la prueba.
   2. Utilice las siguientes aplicaciones para la adquisición de datos y el control de usuario del sistema mientras está en funcionamiento.
      1. [solicitud] VR: Asociado al archivo .XML que muestra el paisaje representativo, abra el archivo para obtener una vista previa del paisaje virtual en los monitores en modo estático. Para una interacción dinámica, abra la configuración emparejada. XLSX en la aplicación de control.
      2. Control [application]: Asociado con el archivo .XSLX, abra esta aplicación para ver los dispositivos accesorios asociados con el sistema. Desde aquí se puede extender y retraer manualmente el tubo de recompensa, dispensar la recompensa líquida y ver la adquisición de datos en tiempo real.
      3. [application] schedule designer: esta aplicación proporciona la capacidad de ajustar archivos XAML para establecer una programación para la activación de eventos dentro del experimento. Por ejemplo, diseñe un disparador personalizable para determinar la duración de la distribución de recompensas y definir la duración de los descansos entre ensayos para ratones.
3. Ejemplo de inicio: Comience decidiendo cómo será el protocolo de estudio en función de los componentes ajustables de los pasos 3.2.1.1-3.2.1.3. Una vez que un protocolo operante esté claramente definido, abra uno de los experimentos de plantilla que venían preestablecidos con el sistema de realidad virtual siguiendo los pasos que se indican a continuación.
   1. Abra la aplicación VR, que se abre en la subcarpeta Datos. Guarde el paisaje virtual creado como un archivo XML. Abra este archivo y el paisaje virtual debería aparecer en los monitores de realidad virtual.
   2. Abra la aplicación Control y navegue hasta el icono Abrir carpeta en la parte superior derecha de la pantalla. Haga clic en el icono, que debería abrir la carpeta Configurs, donde se encuentra el archivo . Se encuentra la configuración experimental XLSX. Abra el archivo . XLSX con el mismo nombre que el archivo .XML abierto en la aplicación VR. Los accesorios del sistema definidos, como la bomba y el motor para el dispositivo de recompensa extensible, ahora son visibles en la pestaña de control dentro de la aplicación.
   3. Iniciar el ensayo experimental, ya que la coordinación entre estas dos aplicaciones permite la creación de un paisaje virtual interactivo. En última instancia, esta integración facilita el seguimiento de datos esenciales, incluida la distancia en el avión XY y la recopilación de recompensas con marcas de tiempo.
4. Adquisición de datos: Extraiga los datos de comportamiento más valiosos del sistema, que son datos de posición con marca de tiempo y recompensas. Estos datos se guardan por separado como archivos de registro.
   1. Datos de posición: Para adquirirlos, siga los pasos que se describen a continuación.
      1. Para adquirir datos de posición XY con marca de tiempo de los ratones, primero abra el archivo de hoja de cálculo del laberinto de adquisición de datos deseado. En la tabla 1, coloque el comando WriteVRAndCamInfoToFile en una de las celdas debajo de las demás de la columna A. Ahora, los datos de posición se guardarán como un archivo CSV con fecha (llamado Log files-MM.DD.YYYY_VRandPathPos.csv) automáticamente en la carpeta de configuraciones después de una prueba.
      2. Para exportar los datos de posición después de una prueba, cierre la aplicación de control y los datos se guardarán en un archivo CSV con fecha. Este archivo contendrá todos los datos específicos de un día en particular, así que tenga cuidado de anotar manualmente cuándo se colocó y se quitó la pelota a cada sujeto. Abra el archivo e impórtelo mediante el juego de caracteres Unicode UTF-8. La columna A está etiquetada como DateTime, haga clic con el botón derecho en la pestaña A y haga clic en Formato de celdas. Vaya a la hora y haga clic en la opción MM/DD/AAAA HH:MM: SS . Ahora, cada evento del sistema se catalogará cronológicamente para un análisis posterior de los datos.
   2. Datos de recompensas: Para adquirirlo, siga los pasos que se describen a continuación.
      1. Los datos sobre la activación de la bomba (dispensación de recompensas) se guardan automáticamente como archivos de registro con fecha en el sistema, por lo que no es necesario introducir un comando como se haría para los datos de posición. Para acceder a ellos, vaya a la subcarpeta Archivos de registro de la carpeta configs.
      2. Repita el paso 3.4.1 para los datos de posición de los datos de recompensa para exportar los datos como un archivo de hoja de cálculo. Abra la carpeta configs y seleccione el archivo de recompensa con fecha (denominado Corredor- MM.DD.AAAA o Corridor_Linear_Run- MM.DD.AAAA) cuando se vea en la carpeta. Esto proporcionará la fecha y la hora en que los ratones adquirieron las recompensas, y se puede usar esto en análisis de datos posteriores dependiendo del paradigma que emplearon.

4. Tareas conductuales

NOTA: De acuerdo con las metodologías establecidas en neurociencia conductual, las tareas formuladas emplean una técnica de aprendizaje asociativo basada en recompensas. Al emplear recompensas inmediatas para reforzar comportamientos específicos, los animales se entrenan de manera efectiva para ejecutar tareas repetitivas, facilitadas por la capacidad de teletransportación de la realidad virtual. Dentro de un marco de comportamiento virtual, la funcionalidad de teletransportación permite a los ratones participar en tareas sin el estrés asociado con la manipulación física, lo que reduce al mismo tiempo la duración de la configuración necesaria para tareas análogas del mundo real. Durante las sesiones de entrenamiento, utilice una iluminación cenital de color rojo tenue dentro del entorno experimental. Esta precaución se recomienda debido a la disminución de la sensibilidad perceptiva visual en ratones a la luz roja, lo que mitiga la posible interferencia con su percepción de las pantallas de realidad virtual (RV), en contraposición al uso de luz blanca²².

1. Habituación
   1. Iniciar la habituación a la cinta de correr esférica al mismo tiempo que su habituación a la regulación de fluidos para asociar el tubo de lamido con la recompensa utilizando la motivación fisiológica correctamente sincronizada. Se recomienda un período de habituación de tres días antes de comenzar el entrenamiento en pista lineal.
   2. El^1er día, manipule los ratones durante 5 minutos después del pesaje. Durante esta interacción, se aconseja agarrar suavemente el implante de la barra de cabeza mientras los ratones están en su jaula, creando familiaridad con dicha manipulación. Presénteles el área donde se encuentra la realidad virtual en este día para permitirles anticipar el entorno espacial en el que se llevarán a cabo los ensayos experimentales. Este día inicial de habituación coincide con el inicio de la regulación de líquidos de 15 mL por cada 100 mg de masa corporal.
   3. En el^{segundo día,} que se alinea con la transición a la etapa de regulación de líquidos de 10 ml por 100 mg de masa corporal, vuelva a manipular los ratones durante 5 minutos. Continúe agarrando suavemente la barra de cabeza repetidamente mientras esté en la jaula. Fije la barra de cabeza al soporte mientras permite que los ratones se familiaricen con la cinta de correr esférica durante 5-20 minutos, ya sea en una pista que se repite infinitamente o sin el programa de software activado. Esto facilita su adaptación a la condición de fijación de la cabeza. Debe anticiparse que los ratones pueden excretar desechos durante este período, que generalmente disminuye durante sesiones sucesivas.
   4. En el^3º día, que corresponde al último día del paradigma de regulación de líquidos (5 mL por 100 mg de masa corporal), manipular a los ratones durante 5 min. Luego, conéctelos de forma segura a la cinta de correr esférica con amortiguación de aire e introdúzcalos a las recompensas líquidas a través del tubo de recompensa.
      1. Introducir la boquilla para lamer a los ratones ingenuos los confundirá al principio, así que asegúrese de que el ratón sea consciente de que se supone que debe beber del tubo.
   5. Sin ser demasiado contundente, aplique las pautas de posicionamiento del mouse a continuación e individualice la posición del mouse en la pelota con respecto al tubo de una manera que les entregue la recompensa de una manera cómoda. Al comenzar, asegúrese de que los ratones estén bebiendo del tubo; Esto ocurrirá en la mayoría de los ratones de forma natural en condiciones de restricción de agua cuando se les presente líquido para beber.
2. Colocación de los ratones
   1. Preposicionamiento: Antes de colocar el ratón en la bola, extienda el tubo de recompensa centrado con una pequeña gota de recompensa en la punta. Extienda el tubo de recompensa antes de colocar el ratón en la bola para evitar cualquier posible lesión resultante de extender inadvertidamente el tubo demasiado hacia adelante una vez que el ratón esté fijo en la cabeza. Eleje el tubo de recompensa 5-15 mm por encima de la cinta de correr esférica, de modo que lamer la boquilla requiera una postura natural de la cabeza orientada hacia adelante.
   2. Fijación de la cabeza: Para fijar la cabeza del ratón, coloque el ratón en el lado dominante del manipulador de la cinta de correr esférica. Luego, usando la mano dominante del manejador, tire del mouse por su barra de cabeza hacia la plataforma de fijación de la cabeza. Coloque la barra de cabeza en la ranura destinada a la fijación, después de lo cual, con la mano no dominante del manipulador, haga clic en la barra de cabeza en su lugar.
   3. Ubicación en la pelota: Individualice la ubicación en la cinta de correr esférica para cada ratón, pero asegúrese de que cumplan con los siguientes requisitos para garantizar la motivación para probar la recompensa y minimizar los niveles generales de estrés.
      1. Alinee el plano sagital medio del ratón con el centro de la cinta de correr esférica. En los casos en que la barra de cabeza no esté recta, asegúrese de que el plano sagital medio del ratón, en lugar de la barra de cabeza, esté en línea con el centro de la colocación. Para mayor claridad visual, consulte la Figura 3C.
      2. Asegúrese de que las patas traseras del ratón no estén a más de 11 cm del ápice de la cinta de correr esférica y que la cabeza esté detrás del ápice. Asegúrese de que las cuatro patas toquen la cinta de correr y que el abdomen pueda tocar la cinta de correr cuando el ratón esté en reposo; Esto favorecerá la marcha adecuada y la estabilidad de la pelota para correr.
      3. Cuando los ratones no corren, esto se denomina rechazo de la bola. Si los ratones continúan congelándose y no intentan correr, es probable que estén experimentando una ansiedad excesiva y, como el investigador, decidió excluirlos del experimento. En este estudio, se utilizó un umbral cuantitativo de 5 días de rechazo de la pelota para determinar la exclusión de los datos.
   4. Sesgo lateral: Cuando los ratones comienzan a habituarse a la rutina de entrenamiento, favorecerán un lado sobre el otro. Esto puede interferir con el rendimiento de la tarea, así que asegúrese de que cualquier preferencia lateral no se deba a la asimetría en la forma en que el animal está montado en la pelota. La tarea del laberinto en Y empleada aquí requiere específicamente que el animal tome decisiones tanto a la derecha como a la izquierda para optimizar la entrega de recompensas, lo que facilita la superación de las preferencias laterales.
   5. Pico de recompensa: Este enfoque implica una maniobra suave conocida como el método del beso, en el que el ratón es guiado hacia el tubo de lamido extendido hasta que su boca casi toca la punta del pico, asegurando así una entrega precisa de la recompensa. Establezca la duración del tubo de recompensa extendido en 1 s cuando los ratones reciban recompensas, permitiendo que el ratón tenga el tiempo suficiente para consumir la gota por completo. Individualice la posición de la boquilla para cada ratón, ya que el tamaño y la posición preferida para cada ratón individual pueden diferir. Asegúrese de que el tubo de recompensa permanezca centrado durante todas las pruebas de estandarización del lamido; El ratón siempre debe esperar recibir la recompensa en la misma ubicación física, independientemente del diseño del laberinto virtual.
      NOTA: Si bien la determinación de esta duración queda a discreción del investigador, estos hallazgos indican que este período de tiempo fue efectivo para facilitar la ingesta completa de recompensa por parte del ratón antes de la retracción del tubo. La Figura 3B muestra un ejemplo de una posición preferible para la colocación.
   6. Pista lineal: De acuerdo con estudios anteriores que emplean metodologías similares, utilice una tarea de pista lineal para investigar dos preguntas clave: el tiempo requerido para entrenar a los ratones para que atraviesen un corredor recto y la tasa de éxito anticipada de la adquisición de recompensas por parte de los ratones.
      1. Asegúrese de que los ratones se hayan aclimatado tanto al paradigma de restricción de fluidos como al hardware experimental.
      2. Realice una sesión diaria de 30 minutos para moverse a lo largo de un corredor virtual lineal comenzando con una longitud de 1 m. Al llegar al final del corredor y recibir la recompensa de la gota de azúcar, teletransporta a los ratones de regreso al punto de partida.
      3. Determine un avance basado en criterios a laberintos más largos (por ejemplo, 1 m, 2 m, 3 m). Avance los ratones a la siguiente longitud de laberinto después de lograr 2 días consecutivos de recibir un promedio de 2 recompensas por minuto (Figura 4A).
      4. Documente los registros diarios de los datos con marca de tiempo relativos a la recuperación de recompensas y la distancia recorrida por los ratones en la cinta de correr esférica para su posterior análisis (Figura 4B-D).
      5. Para los ratones que reciben un promedio de 2 recompensas por minuto en las pistas lineales de 3 m, márquelos como competentes en el paradigma de la pista lineal. Se recomienda que los ratones alcancen esta fase antes de progresar a tareas conductuales más complejas que requieran la toma de decisiones.
   7. Tareas conductuales complejas que requieren toma de decisiones (laberinto en Y): Esta fase explora la viabilidad de progresar de una tarea conductual simple a una más compleja que requiere toma de decisiones. Para lograr esto, cree una tarea Y-Maze de discriminación de señal ideada.
      1. En este paradigma de laberinto en Y^23,24, asegúrese de que los ratones naveguen hacia un punto de elección donde dos brazos se extiendan 45° en cualquier dirección como la forma de una Y. Desactive la rotación desde el punto de inicio del laberinto hasta llegar al punto de elección, dos brazos de color variable, y luego actívelo dentro de la zona de decisión para permitir que el mouse gire hacia la dirección deseada.
      2. Al entrar en el brazo que conduce a la zona de recompensa, desactiva la rotación una vez más. Un brazo negro representa la ruta correcta, mientras que un brazo blanco representa la ruta incorrecta. Utilice el brazo negro y el brazo blanco como señales para adaptarse a las posibles limitaciones en la agudeza visual del ratón, ya que son fácilmente distinguibles, lo que facilita un examen de su uso de la información visual en su forma más simple.
      3. Entrena a los ratones para que naveguen hacia el brazo negro para obtener una recompensa de azúcar, y cada prueba concluye con los ratones teletransportados de vuelta a la ubicación inicial. Incorporar en el diseño experimental un cambio aleatorio de la ubicación de la recompensa entre los lados izquierdo y derecho, asegurando que los ratones asocien la recompensa con las señales visuales en lugar del lado específico.
      4. Utilice los mismos pasos para configurar el laberinto en Y que el corredor lineal. Imitar los criterios de progresión en el paradigma del laberinto en Y a los del corredor lineal: cada prueba dura 30 minutos y los ratones deben alcanzar un umbral de recompensa predeterminado durante 2 días consecutivos. Se recomienda un umbral del 70% de las recompensas adquiridas correctamente en función del rendimiento promedio de las cohortes piloto anteriores en el laberinto Y; está por encima del umbral de probabilidad (50%) y representa un porcentaje razonablemente alcanzable indicativo de que los ratones comprenden la tarea (Figura 5A).
      5. Al llegar al punto de elección, asegúrese de que el mouse seleccione uno de los brazos correctos o incorrectos. Al final del brazo, teletranspórtalo de vuelta al punto de partida para repetir el laberinto en un plazo de 30 minutos.
      6. Este enfoque empleó un enfoque inspirado en la psicofísica visual en el que los laberintos se volvieron cada vez más difíciles de distinguir. Siga la descripción a continuación para conocer la progresión en el paradigma del laberinto en Y.
         1. En el laberinto en Y inicial, presente brazos sólidos en blanco y negro en el punto de elección del laberinto. Si el ratón eligió correctamente el brazo negro durante el 70% de las pruebas durante 2 días consecutivos, progrese a un nivel posterior con tareas de discriminación cada vez más desafiantes. Para lograr esto, introduce gradualmente un 10% adicional del color contrastante en cada brazo en cada nivel de progresión. Por ejemplo, hacer la transición del brazo blanco a estar compuesto por un 90% de blancos y un 10% de negros, y viceversa, lo que hace que la discriminación sea más exigente con cada avance.
            NOTA: La idea de aumentar es que si se puede alcanzar un 50% de blanco/negro, sería un control efectivo ya que los brazos serían indistinguibles. Sin embargo, lo más lejos que los ratones pudieron discriminar visualmente fue 80%:20% (Figura 5B).

Resultados

Este estudio piloto tuvo como objetivo esbozar metodologías para el entrenamiento eficiente de ratones en dos tareas distintas: un corredor simple y una tarea compleja de toma de decisiones (la tarea de discriminación visual del laberinto en Y). Estos datos sirvieron como base para establecer pautas temporales para el entrenamiento conductual en RV.

Los pasos del procedimiento comienzan con el esbozo de la implantación quirúrgica de la barra de cabeza en la Figura 1. Este implante sirve para estabilizar el cráneo del ratón durante las evaluaciones de comportamiento, mejorando así la precisión de las grabaciones neuronales, particularmente cuando se emplea junto con técnicas de electrofisiología o imágenes.

Las figuras 2 y 3 ilustran los componentes de hardware y la configuración del sistema experimental. La Figura 2 detalla el sistema de suministro de agua, que utilizó un método de fuente de placa de Petri. Esto implicó colocar una placa de Petri de 60 mm x 15 mm con el lado cóncavo hacia abajo en el piso de la jaula, asegurar una placa de Petri más pequeña de 35 mm x 10 mm con el lado cóncavo hacia abajo en el centro del plato más grande y colocar otra placa de Petri de 60 mm x 15 mm con el lado cóncavo hacia arriba encima del plato más pequeño para que sirviera como depósito de agua. La altura del plato superior se ajustó cuidadosamente para evitar la contaminación por el material de cama y garantizar que los ratones tuvieran fácil acceso al agua.

En la figura 3 se presentan las directrices de posicionamiento del hardware y del ratón del sistema. La Figura 3A muestra la configuración de realidad virtual, que presentaba una matriz de seis pantallas con una cinta de correr esférica colocada en el centro. La figura 3B muestra la ubicación óptima del ratón en la cinta de correr, con la cabeza alineada en posición natural y las cuatro patas en contacto con la superficie. La Figura 3C compara la colocación correcta e incorrecta del ratón en relación con la barra de cabeza, haciendo hincapié en que el plano sagital medio del ratón debe estar centrado, en lugar de alinearse con la propia barra de cabeza.

La Figura 4 presenta las curvas de adquisición de recompensas en un gráfico de líneas, que ilustra los períodos de aprendizaje esperados para corredores estrechos de 1 m, 2 m y 3 m en VR en función de parámetros predefinidos para la progresión. Representa las velocidades medias de los ratones a lo largo de las respectivas longitudes de pista, demostrando un aumento gradual de la velocidad como evidencia de aprendizaje y mejora de tareas proporcionales al aumento de la dificultad. También se muestra un gráfico de barras que ilustra el número medio de días necesarios para que los ratones alcancen el criterio de las pistas lineales, así como un gráfico de barras que muestra las velocidades medias para cada longitud de pista. A continuación, también se ilustran las etapas progresivas de la tarea de seguimiento lineal aprendida por los ratones. Estas tareas fueron diseñadas para replicar metodologías establecidas en la literatura académica y al mismo tiempo garantizar una curva de aprendizaje factible para los ratones, facilitando su avance a través de los niveles.

Por último, en la Figura 5 se proporcionan datos relativos a la tarea Y-Maze. La figura ilustra la naturaleza progresiva de la tarea, comenzando con una discriminación directa entre brazos blancos y negros sólidos. Esta etapa inicial sirve como un paso fundamental, estableciendo la capacidad de los ratones para distinguir entre señales visuales contrastantes. Los niveles subsiguientes de la tarea introducen una complejidad cada vez mayor al incorporar porcentajes adicionales del color contrastante en cada brazo, desafiando así aún más las habilidades de discriminación de los ratones. El aumento gradual de la dificultad de la tarea se ejemplifica con la transición de brazos sólidos en blanco y negro a brazos compuestos por un 90% de un color y un 10% del otro. En particular, los datos presentados en la Figura 5 indican que, si bien la precisión de la discriminación mejora con cada nivel de progresión, algunos ratones demuestran sistemáticamente un umbral de capacidad de discriminación visual, alcanzando un máximo de 80%/20% de discriminación blanco/negro. Esta observación subraya las limitaciones inherentes a las habilidades de discriminación visual de los ratones dentro del contexto de la tarea Y-Maze, proporcionando información valiosa sobre la viabilidad de la tarea y las capacidades cognitivas de los sujetos. Posteriormente, se detallan las etapas progresivas de la tarea de seguimiento del laberinto en Y, que se diseñaron para alinearse con las metodologías establecidas en la literatura. Estas etapas aseguraron una curva de aprendizaje factible para los ratones, apoyando su avance gradual a través de los niveles.

Figura 1: Instrucciones quirúrgicas para el implante de la barra de cabeza. (A) El sitio de la incisión está marcado en el cráneo del ratón. (B) Los tornillos deben implantarse 1 mm a la izquierda de la sutura interfrontal, ligeramente por debajo del bregma, y 3 mm a la derecha de la sutura interfrontal, ligeramente por encima de la lambda. (C) La barra de cabeza debe colocarse a lo largo de la sutura interfrontal. (D) Aplique cemento dental sobre el implante de la barra de cabeza. (E) Visualización real de la barra de cabeza después de la aplicación de cemento dental. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Sistema de suministro de agua utilizando un método de fuente de placa de Petri. Una placa de Petri de 60 mm x 15 mm se fijó con el lado cóncavo hacia abajo en el suelo de la jaula. Una placa de Petri más pequeña de 35 mm x 10 mm se centró en la placa más grande, con otra placa de Petri de 60 mm x 15 mm colocada con el lado cóncavo hacia arriba en la parte superior para servir como depósito. Esta configuración garantizó que el agua permaneciera no contaminada por la ropa de cama y accesible para los ratones. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Hardware del sistema y posicionamiento de las directrices del ratón. (A) Esto muestra la configuración de realidad virtual utilizada. Se utilizó una configuración de seis pantallas, con la cinta de correr esférica colocada en el medio. (B) Vista lateral de la ubicación óptima del ratón en la cinta de correr esférica. La cabeza del ratón está en una posición natural, mientras que las cuatro patas están en la cinta de correr esférica. (C) Vista superior de la ubicación correcta frente a la incorrecta del mouse con respecto a la barra de cabeza. Para una correcta colocación, el plano sagital medio del ratón debe estar centrado en lugar de la barra de cabeza en sí. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Datos de seguimiento lineal. (A) Los datos presentados representan las recompensas diarias recopiladas dentro de cada período de prueba de 30 minutos. Los ratones progresaron a longitudes de pista más largas una vez que lograron un promedio de 2 recompensas por minuto durante 2 días consecutivos, con un total de 60 recompensas (umbral). (B) A medida que los ratones adquirieron competencia en la tarea, sus velocidades mostraron un aumento gradual, indicativo de la eficacia del refuerzo de recompensa. El gráfico ilustra la velocidad media diaria de cada ratón en la pista en cm/s, lo que representa una progresión lineal en el comportamiento aprendido. (C) Este gráfico de barras ilustra el tiempo que tarda cada ratón en adquirir competencia en longitudes de pista individuales, con las medias respectivas y el error estándar representados para cada longitud de pista. (D) Este gráfico de barras muestra la media y el error estándar de las velocidades diarias medias alcanzadas por cada ratón en varias longitudes de pista. La progresión casi lineal sugiere una mejora aprendida en la velocidad de carrera. (E) Esto ilustra la progresión de la tarea de pista lineal, que requiere 2 días de prueba consecutivos de 60 recompensas antes de avanzar a una versión más larga del laberinto. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Datos de Y-Maze. (A) Esto muestra la distribución de las recompensas adquiridas en diferentes etapas de la progresión del laberinto Y. Este análisis se centró exclusivamente en un subconjunto de cuatro ratones que completaron todas las fases de la pista lineal, lo que garantizó una representación equitativa de los participantes masculinos y femeninos. (B) Esta representación visual ilustra las etapas de la tarea Y-Maze, en la que los ratones avanzan al lograr dos días consecutivos de 70% de opciones correctas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

Este estudio empleó un enfoque integral para investigar las respuestas conductuales de los ratones en entornos de realidad virtual, centrándose en la implementación de procedimientos quirúrgicos, protocolos de restricción de líquidos, configuración del sistema y tareas conductuales. Estos hallazgos contribuyen al campo al proporcionar detalles de procedimientos, plazos para la capacitación y tasas de éxito. Esto permitirá una adopción más efectiva de los procedimientos de RV en ratones y facilitará la planificación y la implementación para los laboratorios interesados en utilizar este procedimiento en sus investigaciones.

La implantación quirúrgica de barras de cabeza fue esencial para facilitar los experimentos de comportamiento de fijación de la cabeza en entornos de realidad virtual. Al seguir cuidadosamente los protocolos establecidos y proporcionar los cuidados postoperatorios adecuados, se garantizó la integración exitosa de las barras de cabeza al tiempo que se minimizaron los efectos adversos en la salud y el comportamiento de los animales. Además, se implementaron protocolos de restricción de líquidos para regular la ingesta de agua y mantener los niveles de hidratación y sed entre los ratones. El proceso gradual de aclimatación y el acceso periódico al agua fueron cruciales para garantizar el bienestar de los animales y facilitar la ejecución de las tareas conductuales.

La configuración del sistema de comportamiento de realidad virtual implicó la integración de componentes de hardware y software para crear entornos virtuales inmersivos para los ratones. La utilización de pantallas virtuales totalmente inmersivas, sistemas de recompensa líquida, pelotas de espuma de poliestireno como cintas de correr esféricas y soportes para la cabeza permitió un control preciso sobre las condiciones experimentales y la adquisición de datos. Las tareas conductuales, incluidos los paradigmas de la pista lineal y el laberinto en Y, se diseñaron cuidadosamente para investigar aspectos clave del comportamiento del ratón, como la locomoción, la toma de decisiones y el procesamiento de recompensas.

A pesar de los mejores esfuerzos para optimizar los procedimientos experimentales, se encontraron varios desafíos durante el estudio. La variabilidad en las respuestas individuales del ratón y los problemas técnicos relacionados con la integración del hardware y el software plantearon desafíos para la recopilación y el análisis de datos. Además, la dependencia de los protocolos de restricción de líquidos requirió un seguimiento cuidadoso del estado de hidratación del animal y el ajuste de los procedimientos experimentales en consecuencia. A veces, los ratones luchaban cuando se colocaban sobre la pelota, no bebían de la boquilla de recompensa o se congelaban y no podían correr sobre la pelota. Aunque algunos de estos desafíos pueden ser temporales, es crucial monitorear a los ratones para asegurarse de que no experimenten impedimentos en su progreso. Los ratones que no muestran avances en comparación con sus compañeros deben ser retirados del estudio. En un experimento similar se eliminaron 4 de 55 ratones debido a su incapacidad para aprender el paradigma²⁵. Los ratones que exhibieron una inmovilidad constante en la pelota durante 5 días consecutivos fueron excluidos del estudio después de evaluaciones exhaustivas de su peso, capacidad para acceder a la boquilla de recompensa para beber y posicionamiento en la pelota para asegurarse de que no hubiera problemas subyacentes. En estos casos, queda a criterio del investigador decidir qué estrategia tomar para reanudar el estudio de manera eficiente.

Estos protocolos de entrenamiento se diseñaron para desafiar progresivamente a los ratones al tiempo que garantizaban su competencia en la ejecución de tareas conductuales. Los criterios para la progresión de la pista lineal al paradigma del laberinto en Y se basaron en la capacidad de los ratones para cumplir con umbrales de rendimiento predeterminados, como lograr días consecutivos de pruebas exitosas y la adquisición de recompensas. La implementación de rigurosos protocolos de entrenamiento permitió evaluar las capacidades conductuales y la adaptabilidad de los ratones a tareas cada vez más complejas. Estos protocolos cuidadosamente estructurados proporcionan un marco sólido para los investigadores en el campo de la neurociencia del comportamiento, ofreciendo un enfoque sistemático para evaluar y entrenar animales para diversos paradigmas experimentales. Al delinear criterios claros para la progresión, los investigadores pueden medir de manera eficiente la curva de aprendizaje de los sujetos experimentales y seleccionar los paradigmas de entrenamiento en consecuencia. Además, este enfoque metodológico fomenta la reproducibilidad y la estandarización en todos los experimentos, facilitando los análisis comparativos y avanzando en la comprensión de los procesos cognitivos y los mecanismos de aprendizaje en modelos animales.

Al diseñar un paradigma de realidad virtual para ratones, es crucial reconocer la gama de enfoques disponibles con respecto a la complejidad de las tareas y la progresión del entrenamiento. Este protocolo ofrece un marco amplio para construir un diseño experimental, pero depende del investigador adaptar aspectos específicos como la entrega de recompensas, el control de sesgos, el tipo de estímulo, la progresión de la tarea y los parámetros del sistema de acuerdo con las necesidades del estudio. Por ejemplo, algunos estudios optan por un enfoque más simplificado, centrándose en la participación inmediata en las tareas. Un ejemplo es Krumin et al., que implementaron una tarea de laberinto en T única y consistente en lugar de emplear un régimen de aprendizaje progresivo entre diferentes tareas. Por el contrario, otros estudios ofrecen diversos componentes en el diseño de los ensayos, como las estrategias de refuerzo de estímulos y las señales auditivas. El estudio utilizó la retroalimentación auditiva como castigo por los ensayos incorrectos y solo proporcionó agua como recompensa por los ensayos correctos²⁶. Por el contrario, Zhao et al. emplearon una solución de sacarosa al 10% como recompensa por los ensayos correctos y no incorporaron ninguna forma de castigo por los ensayos incorrectos²⁷. En su lugar, se centraron en mitigar las respuestas incorrectas a través de métodos como el entrenamiento anti-sesgo, que implicaba aumentar la probabilidad de cambiar la dirección de la señal de la elección anterior del animal y ajustar la cantidad diaria de agua para mejorar la motivación. Las diferencias en el diseño experimental, como la presencia de señales espaciales a lo largo de la tarea, pueden conducir a diversas interpretaciones de la codificación neuronal, como lo demuestra el hallazgo de Zhao et al. de selectividad de células de la corteza parietal posterior explicada por trayectorias y preferencias espaciales, en contraste con las secuencias de activación dependientes de la elección observadas por Harvey et al.^27,28. Es importante tener en cuenta que el hardware específico utilizado incluía seis monitores LCD, una boquilla extensible para lamer y una cinta de correr de bolas de espuma de poliestireno con amortiguación de aire. Hay una serie de diferencias entre los sistemas de realidad virtual de los laboratorios, incluido el uso de proyectores²⁹ frente a monitores de ordenador, cintas de correr no esféricas³⁰ y boquillas fijas¹⁰ frente a boquillas extensibles.

En conclusión, este estudio proporciona información valiosa sobre las respuestas conductuales de los ratones en entornos de realidad virtual y demuestra la viabilidad de emplear tecnología inmersiva para investigar comportamientos complejos. Los futuros esfuerzos de investigación pueden centrarse en el perfeccionamiento de los protocolos experimentales, la exploración de los mecanismos neuronales que subyacen a los procesos de toma de decisiones y la traducción de los hallazgos a aplicaciones clínicas. Al continuar avanzando en la comprensión del comportamiento de los ratones, los científicos pueden dilucidar aún más los circuitos neuronales y los procesos cognitivos que subyacen a los comportamientos complejos tanto en la salud como en la enfermedad.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
2.4 mm Screws (00-96 X 3/32)	Protech International	8L0X3905202F	For Added Headbar Stability
Bupivocaine	Hospira	NDC:0409-1162-19	Local Anesthetic
Buprenorphine	Wedgewood Pharmaceuticals	SKU: BUPREN-INJ010VC	Analgesia
Buzzers	Wahl	1565q	For Shaving Surgical Region
Drill and microinjection robot	Neurostar	17129-IDA	Stereotaxis
GLUture	Zoetis	32046	Surgical Adhesive
Head-bar Implant	Luigs-Neumann	130060	Mouse Head Implant
Heating Pad (Lectro-Kennel)	K&H Manufacturing	100212933	Post-operative
Hemostats	World Precision Instruments	501291	Surgical Tool
Hydrogen Peroxide	Swam	L0003648FB	Cleaning Agent
Isoflurane	Dechra	B230008	Surgical Inhalation Anesthetic
Isoflurane/O2 Delivery device w Nosecomb attachments	Eagle Eye Anesthesia Inc.	Model 50 Anesthesia	Surgical Device
Metabond	Parkell	CB-S380	Adhesive Cement
Microscissors	Fine Science Tools	15000-08	Surgical Tool
Oxygen	Praxair	UN1072	Surgical Oxygen
Povidone-Iodine Swabstick	Dynarex	g172095-05	Surgical Tool
Saline	Hospira	NDC:0409-1966-02	Hydration Agent
Sterile Cotton Tipped Applicator (Q-tips)	Puritan	25-806 2WC	Surgical Tool
Sucrose	Fisher Chemical	CAS 57-50-1	Primary Reinforcer/Motivator/Reward
Tweezers	World Precision Instruments	504505	Surgical Tool
Virtual Reality System	PhenoSys	JetBall-TFT	The JetBall, an air cushioned spherical treadmill allows an animal to navigate effortlessly in a virtual world projected on 6 surrounding monitors.
White petrolatum lubricant eye ointment ointment	AACE Pharmaceuticals	NDC:71406-124-35	Eyelube