Aprovechamiento del poder de las cargas de microARN en pequeñas vesículas extracelulares liberadas de secciones de cerebro humano recién congeladas

Resumen

Aquí, establecemos un protocolo utilizando cantidades mínimas de secciones de tejido cerebral recién congelado y un método de centrifugación de alta velocidad accesible junto con cromatografía de exclusión por tamaño para obtener pequeñas vesículas extracelulares como fuentes de biomarcadores de microARN (miARN) para trastornos neurológicos.

Resumen

Las pequeñas vesículas extracelulares (sEV) son mediadores cruciales de la comunicación célula-célula, transportando diversas cargas como proteínas, lípidos y ácidos nucleicos (microARN, ARNm, ADN). La carga de microARN sEV tiene una utilidad potencial como un poderoso biomarcador de enfermedad no invasiva debido a la capacidad de sEV para atravesar barreras biológicas (por ejemplo, barrera hematoencefálica) y ser accesible a través de varios fluidos corporales. A pesar de los numerosos estudios sobre los biomarcadores de sEV en los fluidos corporales, la identificación de subpoblaciones de sEV específicas de tejidos o células sigue siendo un desafío, particularmente desde el cerebro. Nuestro estudio aborda este desafío mediante la adaptación de los métodos existentes para aislar sEV de cantidades mínimas de secciones de cerebro humano congeladas utilizando cromatografía de exclusión por tamaño (SEC).

Después de la aprobación ética, se cortaron aproximadamente 250 μg de tejido cerebral humano fresco congelado (obtenido del Banco de Cerebros de Manchester [Reino Unido]) de los 3 tejidos donantes y se incubaron en una solución de colagenasa tipo 3/Hibernate-E, con agitación intermedia, seguida de pasos de centrifugación y filtración en serie. A continuación, se aislaron los sEV mediante el método SEC y se caracterizaron siguiendo las directrices de MISEV. Antes de aislar el ARN del interior de estos sEV, la solución se trató con proteinasa-K y RNasa-A para eliminar cualquier ARN extracelular no sEV. La cantidad y la calidad del ARN se comprobaron y se procesaron posteriormente para experimentos de qPCR y secuenciación de ARN pequeño.

La presencia de sEVs se confirmó mediante análisis de seguimiento de nanopartículas de fluorescencia (fNTA) y Western blot para marcadores de superficie (CD9, CD63, CD81). La distribución del tamaño (50-200 nm) se confirmó mediante NTA y microscopía electrónica. La concentración total de ARN dentro de los sEV lisados osciló entre 3 y 9 ng/μL y se utilizó para la cuantificación exitosa mediante qPCR para los microARN candidatos seleccionados. La secuenciación de ARN pequeño en MiSeq proporcionó datos de alta calidad (Q >32) con 1,4-5 millones de lecturas por muestra.

Este método permite el aislamiento y la caracterización eficientes de los sEV a partir de volúmenes mínimos de tejido cerebral, lo que facilita la investigación no invasiva de biomarcadores y es prometedor para los estudios equitativos de biomarcadores de enfermedades, ya que ofrece información sobre enfermedades neurodegenerativas y potencialmente otros trastornos.

Introducción

Las vesículas extracelulares (VE) son uno de los actores clave de la comunicación intercelular en todos los organismos multicelulares¹. Los EV son partículas de membrana bicapa lipídica derivadas de células que pueden facilitar la transferencia de una variedad de cargas de carga, como proteínas, lípidos y ácidos nucleicos, a las células receptoras. Los VE pueden tener una amplia gama de tamaños que van desde 30 nm hasta 1 μM. Los VE pequeños (sEV), definidos como vesículas unidas a lípidos con un diámetro promedio de <200 nm, tienen la capacidad de cruzar la barrera hematoencefálica; por lo tanto, se han implicado en la propagación y exacerbación de enfermedades neurodegenerativas y otras afecciones como la enfermedad de Alzheimer (EA), la demencia frontotemporal (DFT), la enfermedad de Parkinson (EP) y los cánceres ^2,3. Además, dado que los sEV se pueden encontrar en una variedad de biofluidos como la sangre, el líquido cefalorraquídeo (LCR), la saliva e incluso la orina, su uso beneficioso puede abarcar el campo de los biomarcadores y el diagnóstico no invasivo. Por ejemplo, la investigación de la EA puede apuntar al uso de proporciones de proteínas patógenas biofluidas, como tau/Aβ, o incluso Aβ₄₂/Aβ₄₀⁴.

Un cargamento conocido de sEV es el microARN (miARN), un grupo de pequeñas moléculas de ARN no codificantes de alrededor de 22 nucleótidos de longitud que se unen a las regiones 3'-UTR del ARNm y generalmente regulan negativamente la expresión de proteínas. Implicados en muchas funciones celulares, los miARN también se han implicado en la patogénesis de diversas enfermedades, incluidos los cánceres y las enfermedades neurodegenerativas. Cheng et al. llevaron a cabo un análisis de secuenciación de alto rendimiento de las firmas de expresión de miARN sEV derivadas del suero de pacientes con EA⁵. Una vez combinados con los registros de neuroimagen y los factores de riesgo conocidos de la edad, el sexo y la presentación del alelo APOE ε4, se encontró que los resultados predicen la EA con una sensibilidad del 87% y una especificidad del 77%. Además, la investigación ha identificado dos miRNAs de LCR regulados al alza (miR-151a-3p, let-7f-5p) y 3 miRNAs regulados a la baja (miR-27a-3p, miR-125a-5p y miR-423-5p) que potencialmente pueden diagnosticar la EP⁶ en etapa temprana. En las enfermedades patológicas, el estado patológico puede preceder a ciertos síntomas característicos de las enfermedades, mientras que en la neurodegeneración, la acumulación de características patológicas se produce mucho antes que el deterioro cognitivo.

Los microARN son potencialmente un biomarcador más eficaz que las proteínas, debido a sus diversas funciones y a su regulación epigenética de orden superior. Utilizando tejido cerebral, los investigadores pueden identificar potencialmente firmas específicas de miARN de sEV (BDsEV) derivadas del cerebro para enfermedades y sus subtipos. Por ejemplo, los sEV con marcadores neuronales y gliales pueden presentar diferentes cargas de miARN, y el análisis puede dar lugar a métodos más precisos de detección de enfermedades. Además, se sugiere que las BDsEV desempeñan un papel importante en la propagación transsináptica de proteínas neuropatógenas⁷. Informes previos han sugerido inmunoprecipitación y ultracentrifugación en gradiente de densidad (gradiente de sacarosa) para obtener sEVs a partir de tejido cerebral fresco congelado ^8,9. Sin embargo, estos enfoques requieren una infraestructura específica con ultracentrífuga y métodos de purificación posteriores para obtener muestras de sEV de alta calidad¹⁰. Informes más recientes han sugerido varias modificaciones y mejoras al enfoque 11,12,13; sin embargo, a pesar de esto, el aislamiento y el estudio de los microARN derivados de sEV a partir de tejidos humanos aún no se aplican ampliamente. El enfoque descrito en este protocolo tiene como objetivo proporcionar un protocolo refinado y paso a paso para el estudio de sEV derivado del cerebro para mejorar la accesibilidad a esta técnica. Establecimos un protocolo utilizando cantidades mínimas de tejido cerebral, a partir del cual aislamos sEV puros mediante cromatografía de exclusión por tamaño y mostramos datos de secuenciación de próxima generación de alta calidad a partir de la carga de microARN de estos sEV.

Protocolo

El trabajo ha sido aprobado éticamente por el Manchester Brain Bank (referencia REC 09/H0906/52) y por el comité de ética de la Universidad de Salford (ID de solicitud: 3408).

1. Ruptura de la matriz intracelular mediante colagenasa en secciones de tejido cerebral congelado

1. Cortar en rodajas finas 250 mg de tejido cerebral congelado (fragmentos de alrededor de 0,4 mm de grosor) con un bisturí esterilizado en una placa fría y añadir 2 mL de solución de colagenasa tipo III/Hibernación E de 75 U/mL.
2. Incubar cada muestra en un baño de agua a 37 °C durante 20 min. En el punto de 5 minutos, invierta cada muestra dos veces para mezclar; en el punto de 10 minutos, pipetee cada muestra tres veces suavemente con una tira desechable de plástico de 10 ml.
3. Coloque cada muestra en hielo y agregue 1x cóctel de inhibidores de proteasa y 1x inhibidor de fosfatasa. Esto detiene la reacción enzimática y es el punto final de la digestión utilizando colagenasa tipo III.
4. Centrifugar cada muestra de tejido cerebral a 300x g durante 10 min a 4 °C. Recoja cada sobrenadante y centrifuga a 2000 x g durante 15 min a 4 °C.
5. Vuelva a recoger cada sobrenadante y filtre a través de un filtro de 0,22 μm. Centrifugar cada filtrado a 10 000 x g durante 48 min a 4 °C.
6. Recoja el sobrenadante y agregue tampón de precipitación en una proporción de 2:1 a cada muestra. Incubar durante la noche a 4 °C.
7. Centrifugar cada muestra a 10 000 x g durante 96 min a 4 °C y resuspender el pellet en 100 μL de PBS libre de vesículas extracelulares (EV).

2. Preparación de columnas de cromatografía de exclusión por tamaño

1. Antes de usar, equilibre la columna SEC preparada previamente a temperatura ambiente (RT) durante 15 min.
   NOTA: La tapa inferior debe quitarse antes que la tapa de rosca.
2. Después del equilibrio, retire el tampón conservante de la parte superior de la columna y lave la columna dos veces con 250 μL de PBS sin EV. Cada lavado de PBS se deja entrar en la columna por gravedad.

3. Aislamiento de pequeñas vesículas extracelulares mediante cromatografía de exclusión por tamaño

1. Añada el pellet resuspendido a la parte superior de la columna SEC y centrifugue la columna a 50 x g durante 30 s. Deseche el flujo continuo.
2. Agregue 180 μL de PBS libre de EV a la parte superior de la columna SEC y centrifugue la columna a 50 x g durante 1 minuto, permitiendo que los sEV derivados del cerebro eluyan de la columna.
   NOTA: La parte del protocolo detallada anteriormente se resume en la Figura 1.

4. Confirmación de marcadores de vesículas extracelulares pequeñas mediante Western blot

1. Para lisar las sEV antes del análisis de Western blot (para garantizar que se analicen todas las cargas de membrana y citosólicas), diluya la muestra de sEV aislada 1:1 en tampón de lisis y extracción (1x inhibidor de la proteasa y 1x inhibidor de la fosfatasa).
2. Agitar la muestra a 4 °C durante 30 min.
3. Centrifugar la muestra a 14 000 x g durante 15 min.
4. Recoja el sobrenadante de proteínas y mida las concentraciones de proteínas utilizando un kit de ensayo de proteínas.
5. Mezcle las muestras con 4 tampones Laemmli y cargue 20 μg de proteína en cada pocillo contra una escalera de proteínas previamente teñida.
6. Una vez resueltas, transfiera las proteínas a una membrana de nitrocelulosa de 0,45 μm. Después de la transferencia, bloquee la membrana durante 2 h en BSA al 5%.
7. Incubar las membranas con anticuerpos primarios (Tabla 1) durante la noche.
8. Lavar la membrana tres veces con tampón de lavado (1% Tween20 en PBS) y teñir con un anticuerpo secundario anti-ratón. Después, lavar tres veces con tampón de lavado (1% Tween20 en PBS).
9. Siga los pasos anteriores en el manuscrito antes de obtener imágenes de las manchas.
10. Imagen utilizando sustrato de peroxidasa de rábano picante (HRP).

5. Confirmación de pequeñas vesículas extracelulares mediante análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA)

1. Realice NTA para analizar la concentración y el tamaño de todas las partículas de la muestra. Para ello, diluya cada muestra en PBS con un factor de dilución de 1:1000.
2. Inyecte la muestra en el instrumento NTA y lea la muestra a una longitud de onda de 550 nm. En esta etapa, use la cantidad de partícula para medir la cantidad de proteína por partícula (generalmente expresada en femtogramo) como se recomienda en las pautas de MISEV.
3. A continuación, para NTA fluorescente, diluya la mascarilla celular naranja (CMO) (tiñe todas las partículas biológicas dentro de una muestra) en PBS por un factor de dilución de 1:1000. A partir de esto, diluya el colorante CMO usando una muestra de sEV por un factor de dilución de 1:10 - Incube este paso de dilución en la oscuridad durante 30 min a 4 °C.
4. Diluir la segunda dilución de CMO usando PBS en un factor de dilución de 1:1000.
   NOTA: La dilución final del tinte CMO debe ser 1:10 000 000.
5. Lea el CMO de cada muestra de sEV a una longitud de onda de 550 nm utilizando el instrumento NTA.
6. Para los anticuerpos fluorescentes de tetraspanina (ver Tabla de Materiales), en primer lugar, diluya cada anticuerpo respectivo en PBS por un factor de dilución de 1:10. A partir de esto, diluya cada uno de los tintes usando una muestra de sEV por un factor de dilución de 1:10 - Incubar el paso de dilución en la oscuridad durante 2 h a 4 °C.
7. Diluir la segunda dilución de anticuerpos usando PBS en un factor de dilución de 1:1000.
   NOTA: La dilución final de cada anticuerpo de tetraspanina debe ser de 1:100 000.
8. Lea las lecturas de anticuerpos fluorescentes de la muestra de sEV a una longitud de onda de 550 nm utilizando el instrumento NTA.

6. Confirmación de pequeñas vesículas extracelulares por microscopía electrónica de transmisión (TEM)

NOTA: Este protocolo fue realizado por el Centro de Microscopía Biomédica de la Universidad de Liverpool.

1. En primer lugar, fije las muestras de sEV con glutaraldehído y tiña con acetato de uranilo.
2. A través de una serie graduada de alcoholes, deshidrate la muestra y prepárela para TEM.
3. Imágenes de muestras utilizando un microscopio electrónico de transmisión adecuado.

7. Tratamiento con proteinasa K y RNasa A

1. A 50 μL de EV derivadas del cerebro aisladas, añadir 1 μL de 20 μg/μL de proteinasa K e incubar a 37 °C durante 30 min.
2. Detenga cada reacción agregando 1x cóctel de inhibidores de proteinasa e incube en hielo durante 10 minutos.
3. Después de la incubación, añadir 1 μL de 10 μg/μL de RNasa A a cada muestra y seguir incubando a 37 °C durante 30 min.
   NOTA: Pase inmediatamente a la sección 8.

8. Aislamiento de ARN total a partir de pequeñas vesículas extracelulares

1. Para aislar el ARN total, agregue 700 μL de reactivo de lisis de recuperación de ARN de alta calidad a 50 μL de muestra de EV derivado del cerebro (BDsEV). Agite cada muestra durante 1 h.
2. Añadir 140 μL de cloroformo, agitar enérgicamente cada muestra durante 20 s y dejar incubar a RT durante 3 min.
3. Centrifugar la muestra a 12 000 x g durante 15 min a 4 °C y recoger la interfase de la muestra. Agregue 1,5 veces el volumen de etanol al 100%.
4. Añadir 700 μL de mezcla de interfase/etanol, columnas de aislamiento de ARN y centrífuga a ≥8000 x g durante 15 s a RT.
   NOTA: Repita este paso utilizando todas las muestras de interfase/etanol.
5. A la columna, añadir 700 μL de tampón de lavado y centrifugar a ≥8000 x g durante 15 s. Deseche el flujo continuo.
6. Añadir 500 μL de TPE RPE y volver a centrifugar a ≥8000 x g durante 15 s. Deseche el flujo continuo.
7. Agregue 500 μL de etanol al 80% y centrifugue a ≥8000 x g durante 2 min. Deseche el flujo continuo.
8. En este punto, seque la membrana de la columna centrifugando las columnas a toda velocidad (>8000 x g) durante 5 min con la tapa abierta.
9. Transfiera la columna a un nuevo tubo de recolección, agregue 14 μL de agua libre de ARNasa directamente a la membrana de la columna y centrifugue a ≥8000 x g durante 1 minuto para eluir el ARN total de los BDsEV.
10. Cuantificar el microARN total con muestras utilizando un kit de ensayo de cuantificación de miARN, donde las muestras se midieron en un fluorómetro de cuantificación, seleccionando el tipo de ensayo de miARN.

9. Secuenciación de ARN pequeño

1. Después de la cuantificación del miARN dentro de la muestra, sintetice una biblioteca de ADNc utilizando el kit de preparación de biblioteca Small RNA-Seq.
   NOTA: Con este protocolo, la generación de bibliotecas incluía cuatro pasos: ligadura del adaptador 3', purificación, ligadura del adaptador 5' y transcripción inversa, donde, al final, se forma una biblioteca de ARN/ADNc. Después de la generación de la biblioteca, se produce la amplificación de PCR de punto final con la adición de cebadores de índice (utilizados con fines de multiplexación), después de lo cual se purifican las muestras.
2. Para probar la calidad del ARN, utilice un ensayo de aplicación de control de calidad que detalle el tamaño de cada preparación y la intensidad máxima.
3. Para probar la concentración de ADN, mida la cuantificación de ADN en un fluorómetro de cuantificación, seleccionando el tipo de ensayo dsDNA.
4. Prepare las muestras para Small RNA Seq utilizando el kit de reactivos, después de lo cual las muestras se cargan en la celda de flujo.

Resultados

Para confirmar la presencia de BDsEVs, se utilizaron tres técnicas: western blot, NTA y TEM (Figura 3). Los resultados del Western blot (Figura 3A y Archivo Suplementario 1) muestran la presencia de los cinco marcadores positivos (CD9, CD63, CD81, Flot-1 y TSG101) y la ausencia de Calnexina en los sEV (utilizados como control negativo), lo que confirma que no hay contaminación con el contenido celular. Como er...

Discusión

Este protocolo modificado y mejorado para aislar pequeñas vesículas extracelulares derivadas del cerebro y su carga de microARN demuestra la viabilidad de utilizar un mínimo de tejido sin comprometer la calidad y cantidad de los productos posteriores. En el campo del descubrimiento de biomarcadores, la identificación de identificadores moleculares específicos de los tipos de células y tejidos puede conducir a medios más accesibles de pruebas diagnósticas no invasivas que utiliza...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bovine Serum Albumin	Merck	A9418-100G
Cell Mask Orange Plasma Membrane Stain	ThermoFisher Scientific	C10045
Collagenase Type-III	StemCell Technologies	07422
ExoSpin Columns and Buffer	Cell Guidance Systems Ltd.	EX01-50	This kit contains SEC columns used in this experiment, precipitation buffer and EV free PBS.
Halt Protease Inhibitor Cocktail (100x)	ThermoFisher Scientific	78429
Hibernate-E Medium	ThermoFisher Scientific	A1247601
Laemmli Sample Buffer (4x)	BioRad	1610747
Lexogen Small RNA-Seq Library Prep Kit	Lexogen	052.24	This kit contains Small RNA preparation reagent box with i7 Index primer plate.
miRNeasy Micro Kit (50)	Qiagen	217084	This kit contains high-quality RNA recovery lysis reagent (Qiazol), RNA isolation columns, isolation buffers (RWT, RPE) and RNase free water.
MiSeq Reagent Kit v3	Illumina	MS-102-3001	This is the Illumina Preparation Kit
Nitrocellulose Membrane, 0.45 μm	ThermoFisher Scientific	88018
PE/Dazzle 594 anti-human CD63 Antibody	BioLegend	143914	Used for fNTA Analysis
PE/Dazzle 594 anti-human CD81 Antibody	BioLegend	349520	Used for fNTA Analysis
PE/Dazzle 594 anti-human CD9 Antibody	BioLegend	312118	Used for fNTA Analysis
PhosSTOP	Merck	4906845001
Pierce BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher Scientific	23225
Proteinase K	ThermoFisher Scientific	25530049
Qubit microRNA Assay Kit	ThermoFisher Scientific	Q32880
Qubit 1X dsDNA HS assay kit	ThermoFisher Scientific	Q33230
Qubit 3.0 Fluorometer	ThermoFisher Scientific	Q33216
RIPA Lysis and Extraction Buffer	ThermoFisher Scientific	89901
RNase A	ThermoFisher Scientific	EN0531
SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate	ThermoFisher Scientific	34094