Una plataforma de matriz de electrodos múltiples para modelar la epilepsia utilizando ensamblajes cerebrales derivados de células madre pluripotentes humanas

Resumen

Este protocolo tiene como objetivo platear de manera estable ensamblajes fusionados dorsal-ventral en matrices de electrodos múltiples para modelar la epilepsia in vitro.

Resumen

Los organoides del cerebro humano son estructuras tridimensionales (3D) derivadas de células madre pluripotentes humanas (hPSC) que recapitulan aspectos del desarrollo del cerebro fetal. La fusión de organoides cerebrales dorsales con ventrales especificados regionalmente in vitro genera ensamblajes, que tienen microcircuitos funcionalmente integrados con neuronas excitadoras e inhibidoras. Debido a su complejidad estructural y a la diversidad de la población de neuronas, los ensamblajes se han convertido en una herramienta útil in vitro para estudiar la actividad aberrante de la red. Los registros de matrices de electrodos múltiples (MEA) sirven como método para capturar potenciales de campo eléctrico, picos y dinámica de red longitudinal de una población de neuronas sin comprometer la integridad de la membrana celular. Sin embargo, adherir ensamblajes a los electrodos para registros a largo plazo puede ser un desafío debido a su gran tamaño y área de superficie de contacto limitada con los electrodos. Aquí, demostramos un método para colocar ensamblajes en placas MEA para registrar la actividad electrofisiológica durante un período de 2 meses. Aunque el protocolo actual utiliza organoides corticales humanos, se puede adaptar ampliamente a organoides diferenciados para modelar otras regiones del cerebro. Este protocolo establece un ensayo electrofisiológico robusto y longitudinal para estudiar el desarrollo de una red neuronal, y esta plataforma tiene el potencial de ser utilizada en el cribado de fármacos para el desarrollo terapéutico en la epilepsia.

Introducción

Los organoides cerebrales derivados de células madre pluripotentes humanas (hPSC) son estructuras 3D espacialmente autoorganizadas que reflejan la arquitectura del tejido y las trayectorias de desarrollo in vivo. Están compuestas por múltiples tipos de células, incluyendo progenitores (células neuroepiteliales, glía radial, progenitores neuronales, progenitores gliales), neuronas (neuronas excitadoras de tipo cortical e interneuronas inhibidoras) y células gliales (astrocitos y oligodendrocitos)^1,2. Los ensamblajes representan la próxima generación de organoides cereb....

Protocolo

Todos los procedimientos experimentales que se muestran a continuación se llevaron a cabo de acuerdo con las pautas éticas de la Junta de Revisión Institucional de la Facultad de Medicina de la Universidad de Michigan y el Comité de Supervisión de la Investigación de Células Madre Pluripotentes Humanas. Las líneas de iPSC utilizadas en este protocolo y los experimentos representativos se derivaron de fibroblastos de prepucio humano obtenidos de una fuente comercial. Los detalles de las líneas celulares, los reactivos y el equipo utilizados en este estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

Discusión

Se han utilizado métodos basados en MEA para registros electrofisiológicos de la actividad de la red en ensamblajes derivados de iPSC para el modelado in vitro de la epilepsia^22,23. Esta plataforma propuesta que integra conexiones sinápticas excitadoras e inhibidoras tiene el potencial de abordar los mecanismos de hiperexcitabilidad neuronal y el papel de las interneuronas corticales en el proceso de epileptogénesis........

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm Corning Non TC-treated culture dishes	Corning	08-772-32	For suspension culture on the shaker
100 mL Beaker	Fisher Scientific	FB100100
100% Ethanol	Fisher Scientific	BP28184-4L
2-Mercaptoethanol (β-ME)	Thermo Fisher	21985023	Working concentration 100 μM
48-well cell culture plate	Fisher Scientific	50-202-140
6-well cell culture plate	Fisher Scientific	07-200-83
Aggrewell 800	Fisher Scientific	501974754
Allegra X-14R Refrigerated Centrifuge	Beckman Coulter	BE-AX14R
Allopregnanolone	Cayman	16930	Suspended 5mg into DMSO to get 1 mM stock solution. Aliquot and freeze at −80 °C. Dilute at 1:10,000 for use. Working concentration 100 nM.
Automated cell counter	Thermo Fisher	AMQAX2000
Axion CytoView MEA 6-well plates	Axion Biosystems	M384-tMEA-6B
Axion Maestro MEA platform	Axion Biosystems	Maestro	With temp environmental control
B-27 supplement (regular, with Vitamin A)	Thermo Fisher	21985023
B-27 supplement (without Vitamin A)	Thermo Fisher	12587010
Basement membrane matrix- Geltrex	Thermo Fisher	A1569601
Bead bath	Fisher Scientific	10-876-001	Isotemp
Benchtop inverted microscope	Olympus	CKX53	Kept in laminar flow clean bench
Bicuculline	Sigma-Aldrich	14340	Working concentration 10 μM
Bleach	CLOROX	67619-26
Borate buffer 20x	Thermo Fisher	28341	Working concentration at 1x
BrainPhys media	StemCell Technologies	5790
Cell dissociation reagent (StemPro Accutase)	Thermo Fisher	A1110501
Celltron orbital shaker	HT-Infors	I69222
Detergent/enzyme (Terg-A-Zyme)	Sigma-Aldrich	Z273287	Working concentration 1% m/v
DMEM/F12 + HEPES/L-Glutamine	Thermo Fisher	113300
DMSO	Sigma-Aldrich	67685
Dorsomorphin	Sigma-Aldrich	P5499	Dissolve 5mg into DMSO to get 10 mM stock solution. Aliquot and freeze at −20 °C. Dilute at 1:2000 for use. (working concentration 5 μM)
D-PBS w/o calcium or magnesium	Thermo Fisher	14190144
Glial cell line-derived neurotrophic (GDNF)	Peprotech	450-10	Dissolve 100 μg in 1mL of PBS to 100 μg/mL. Aliquot and freeze at −20 °C. Dilute at 1:5000 for use. (working concentration 20 ng/mL).
GlutaMAX supplement	Thermo Fisher	35050061
Hemacytometer	Election Microscopy Sciences	63510-20
HEPES	Thermo Fisher	15630080
Heraguard ECO Clean Bench	Thermo Fisher	51029692
Humidity controlled cell culture incubator	Thermo Fisher	370	set to 37 °C, 5% CO2
IWP-2	Selleckchem	S7085	Aliquot and freeze at −80 °C. It will precipitate if thawed at room temp. Frozen aliquots should be placed directly into 37 °C before use.
Knockout serum replacement (KOSR)	Thermo Fisher	10828010
mTeSRplus (medium + supplements)	StemCell Technologies	100-0276	cGMP, stabilized feeder-free medium for human iPSC cells
N2 supplement	Thermo Fisher	17502048
Neurobasal A	Thermo Fisher	21103049
Non-essential amino acids (NEAA)	Thermo Fisher	11140050
NT3	Peprotech	450-03	Dissolve 100 μg in 1mL of PBS to 100 μg/mL. Aliquot and freeze at −20 °C. Dilute at 1:5000 for use. (working concentration 20 ng/mL).
NuFF Human neonatal foreskin fibroblasts	MTI-GlobalStem	GSC-3002
Parafilm	PARAFILM	P7793
Penicilin/Streptomycin	Thermo Fisher	15140122
Pipette (P10, P200, P1000)	Eppendorf	EP4926000034	Autoclaved cut P1000 tips for organoid collection
Poly (Ethyleneimine) (PEI)	Sigma-Aldrich	P3143	Dilute stock in sterile borate buffer. Working concentration 0.07%. See details in manuscript.
Recombinant human epidermal growth factor (EGF)	R&D Systems	236-EG-200	Suspended in PBS. Aliquot and freeze at -20 °C.
Recombinant Human fibroblast growth factor (FGF)-basic	Peprotech	100-18B	Suspended in PBS. Aliquot and freeze at -20 °C.
Recombinant human-brain-derived neurotrophic factor (BDNF)	Peprotech	450-02	Centrifuge briefly before reconstitution. Dissolve 100 μg in 1 mL of PBS to 100 μg/mL. Aliquot and freeze at −20 °C. Dilute at 1:5000 for use. (working concentration 20 ng/mL).
Retinoic acid (RA)	Sigma-Aldrich	R2625	Dissolve 100 mg into 3.3 mL of DMSO to get 100 mM stock solution. Aliquot the stock 100 μL/tube and freeze at −80 °C. Take 200 μL of 100 mM stock and dilute 10x (add 1.8 mL of DMSO) to make 10 mM stock. Aliquot 50 μL/tube and store at −80 °C. Dilute at 1:100,000 for use. (working concentration 100 nM).
ROCK inhibitor Y-27632	Tocris	1254	1:200 from 10 mM stock
SAG (smoothened agonist)	Selleckchem	S7779	Aliquot and freeze at −80 °C. Stock concentration 1mM. Use at 1:10,000 dilution (working concentration 100 nM).
SB-431542	Tocris	1614	Dissolve 5mg into 1.3 mL of DMSO to get 10 mM stock solution. Aliquot and freeze at −80 °C. Dilute at 1:1000 for use. (working concentration 10 μM)
Serological pipette filler	Fisher Scientific	14-387-166
Steriflip vacuum tube top filter	Sigma-Aldrich	SE1M179M6
Sterile cell culture hoods	Baker Company	SG-600
Trypan blue solution (0.4%)	Thermo Fisher	15250061
Trypsin-EDTA (0.25%)	Thermo Fisher	25200056
Zoom stereomicroscope	Olympus	SZ61/SZ51	Kept in laminar flow clean bench