Desarrollo de un sistema de protoplasto de repollo para el estudio de la tolerancia a la hipoxia en Brassica

Resumen

Este protocolo describe un sistema eficiente de protoplasto mesophyll de repollo. Se probaron varios tratamientos con deficiencia de oxígeno y el sistema mostró una alta activación de genes que responden a la hipoxia, lo que facilitó los estudios de los mecanismos genéticos y moleculares de la tolerancia a la inundación en vegetales Brassicaceae .

Resumen

A medida que el cambio climático trae lluvias más intensas, el repollo, una verdura clave de Brassicaceae , enfrenta pérdidas significativas de rendimiento debido al estrés por hipoxia inducido por inundaciones. Para identificar los mecanismos de tolerancia a las inundaciones en las coles, se necesita una plataforma versátil para los estudios genéticos funcionales que superen la naturaleza recalcitrante a la transformación de las coles. En este estudio, se desarrolló un sistema de expresión transitoria de protoplastos de repollo y un protocolo de inducción de hipoxia de protoplasto correspondiente. Este protocolo logró un alto rendimiento e integridad del aislamiento de protoplastos de hojas de repollo, con una eficiencia de transfección superior al 40% utilizando condiciones enzimáticas optimizadas. Para aliviar la posible influencia hipóxica antes de los tratamientos, la solución W5 se burbujeó con gas oxígeno para aumentar los niveles de oxígeno disuelto. Se probaron varios productos químicos para ajustar los niveles de oxígeno y tratamientos fisiológicos de eliminación de oxígeno, incluidos EC-Oxyrasa, OxyFluor, sulfito de sodio y un paquete absorbente de oxígeno. Los ensayos de luciferasa dual mostraron que los promotores de los genes de respuesta respiratoria anaeróbica BoADH1 y BoSUS1L se activaron en los protoplastos de repollo después de los tratamientos con hipoxia, con el nivel de inducción más alto observado después del tratamiento con el paquete absorbente de oxígeno. En resumen, el sistema de expresión transitoria de protoplasto de repollo combinado con el tratamiento de hipoxia demuestra una plataforma eficiente y conveniente. Esta plataforma puede facilitar los estudios de la función génica y los mecanismos moleculares asociados con las respuestas de hipoxia en las coles.

Introducción

El cambio climático global ha exacerbado las inundaciones, que se han convertido en un problema cada vez más crítico en todo el mundo. En las últimas décadas se ha observado una tendencia al alza en la frecuencia de las inundaciones, lo que ha provocado pérdidas sustanciales de cultivos ^1,2. La col (Brassica oleracea var. capitata L.), una hortaliza de gran importancia mundial, es susceptible a los efectos adversos de las lluvias torrenciales, lo que requiere el desarrollo de cultivares de repollo tolerantes a las inundaciones para garantizar una producción sostenible frente a eventos climáticos extremos. Por lo tanto, comprender los mecanismos moleculares asociados con el estrés por inundación en el repollo es esencial para enfrentar este desafío.

Para comprender los mecanismos de regulación génica en plantas en condiciones sumergidas, las líneas transgénicas son ampliamente utilizadas para estudios genéticos funcionales. Sin embargo, este enfoque se ve limitado por los altos costos, la transformación que requiere mucho tiempo y los procesos de subcultivo, así como por las bajas eficiencias de transformación en muchas especies de cultivos, lo que requiere el desarrollo de metodologías alternativas. Los sistemas de expresión transitoria basados en protoplastos se han aplicado ampliamente en la investigación molecular de plantas como una alternativa versátil y eficiente. Estos sistemas facilitan las investigaciones sobre la actividad de los promotores, las vías de señalización en respuesta a las señales ambientales, las interacciones proteína-proteína o proteína-ADN, y la localización subcelular³. El establecimiento de sistemas de expresión transitoria de protoplasto se ha reportado no solo en plantas modelo ^4,5 sino también en cultivos económicamente importantes como la caña de azúcar⁶, el clavel⁷, las orquídeas Phalaenopsis ⁸ y la berenjena⁹. Además, estos sistemas se han implementado con éxito en plantas leñosas, como Camellia oleifera¹⁰y Populus trichocarpa¹¹. Sin embargo, los protocolos para la aplicación de sistemas de protoplastos para estudiar verduras de hoja bajo estrés por hipoxia inducida por inmersión son limitados. Por lo tanto, se ha desarrollado un protocolo integrado en este trabajo para aquellos interesados en estudiar las respuestas de hipoxia en vegetales de hoja utilizando un sistema de expresión transitoria de protoplastos de repollo.

Para llevar a cabo la respuesta de hipoxia inducida por inmersión a nivel celular, se han empleado varias metodologías de eliminación de oxígeno en estudios anteriores para simular entornos hipóxicos. Estos incluyen el uso de EC-Oxyrasa, OxyFluor, sulfito de sodio y bolsas consumidoras de oxígeno. La EC-oxirasa se utiliza normalmente para el tratamiento anaeróbico en líneas celulares humanas¹² y protoplastos de Arabidopsis ¹³. Se ha descubierto que OxyFluor es eficaz para mitigar el fotoblanqueo causado por especies reactivas de oxígeno durante la obtención de imágenes de fluorescencia de células vivas^14,15. El sulfito de sodio se ha empleado en el tratamiento anaeróbico de nematodos¹⁶ y, más recientemente, en protoplastos de arroz, junto con técnicas como los ensayos de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP)¹⁷. Los paquetes absorbentes de oxígeno, utilizados principalmente para el cultivo bacteriano anaeróbico¹⁸, también han demostrado eficacia para inducir la activación de los promotores de ZmPORB1 en los protoplastos de maíz en condiciones anaeróbicas¹⁹.

El presente trabajo tiene como objetivo establecer una línea robusta para el aislamiento y la expresión transitoria de protoplastos de repollo. Posteriormente, se evaluó la eficacia de varios tratamientos de ajuste de oxígeno mediante la evaluación de la actividad promotora de los genes de respuesta anaerobia mediante ensayos de luciferasa dual. Se anticipa que el protocolo desarrollado en este estudio será valioso para futuras investigaciones relacionadas con el estrés por inmersión o hipoxia en sistemas Brassica .

Protocolo

En este estudio se utilizaron dos cultivares comerciales de repollo (B. oleracea var. capitata): 'Fuyudori' y '228'. En la Figura 1 se muestra una representación gráfica del flujo de trabajo del protocolo. Los detalles de los reactivos y el equipo utilizado en este estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Preparación de plántulas de repollo.

1. Siembre las semillas de col 'Fuyudori' y '228' con sustrato vegetal comercial en agujeros redondos de forma cuadrada (4,5 cm de profundidad x 4,5 cm de alto) de bandejas de tapón de 48 pocillos (49 cm de largo x 28 cm de ancho x 5 cm de alto). Incrusta las semillas aproximadamente a 1 cm de profundidad en el sustrato.
2. Cultive las plántulas de repollo en una sala de crecimiento a 22 °C con un ciclo de luz-oscuridad de 16/8 h. Mantener la intensidad de la luz de 100 μmol ^m-2·^s-1 (tubo fluorescente blanco) durante la fase de luz.
3. Después de 2-3 semanas de crecimiento, use plántulas de repollo en la etapa de 2 hojas para un mayor aislamiento del protoplasto mesófilo.
   NOTA: El tamaño sugerido de las plántulas de repollo es una etapa de 2 hojas, en la que la segunda hoja verdadera está completamente expandida, pero la tercera hoja verdadera no está expandida y su longitud es inferior a 1 cm (Figura 2A). Para sincronizar las etapas de desarrollo de las plántulas de repollo, las semillas de 'Fuyudori' deben sembrarse aproximadamente 2 días antes que las semillas de '228' debido a sus diferentes tasas de crecimiento. Este ajuste asegura un crecimiento y madurez uniformes entre las plantas de repollo en la etapa deseada.

2. Aislamiento de protoplastos de repollo

1. Prepare 12,5 mL de solución enzimática (Tabla 1) antes de cada aislamiento de protoplasto.
   1. Precalentar una solución con 10 mM MES (pH 5,7) y 0,6 M de manitol a 55 °C. Continúe calentando la solución a 55 °C durante 10 minutos después de agregar 1,5% de celulasa R10 y 0,75% de macerozima R10.
   2. Después de que la solución enzimática se enfríe a temperatura ambiente (25 °C), agregue 10 mM de CaCl₂ y 0,1% de albúmina sérica bovina (BSA). Filtro: esterilice la solución enzimática preparada en una placa de Petri de 9 cm utilizando un filtro de jeringa de 0,22 μm.
      NOTA: El precalentamiento de la solución aumenta la solubilidad de la enzima e inactiva la proteasa. Los efectos de la digestión varían en función de los diferentes tipos de enzimas celulasas. La combinación de celulasa R10 y macerozima R10 es adecuada para el aislamiento de protoplastos de repollo.
2. Recoja las segundas hojas verdaderas recién expandidas de cinco a ocho plántulas de repollo y córtelas en tiras de 0,5-1,0 mm con una cuchilla de afeitar afilada. Transfiera inmediatamente las tiras de hojas a la solución enzimática recién preparada.
   NOTA: Es crucial seleccionar hojas sanas y designadas del repollo en la etapa adecuada. Las segundas hojas verdaderas recién expandidas de las plántulas de repollo en la etapa de 2 hojas proporcionan la mayor eficiencia de aislamiento de protoplastos. Las plantas demasiado maduras, los cotiledones o las hojas envejecidas no se recomiendan para el aislamiento de protoplastos. De cinco a doce hojas verdaderas bien expandidas pueden producir con éxito protoplastos de repollo en 12,5 mL de solución enzimática. El número de hojas necesarias para el aislamiento de protoplastos depende de la cantidad deseada de protoplastos necesarios. Por lo general, los protoplastos obtenidos de cinco a ocho hojas son suficientes para procedimientos experimentales posteriores.
3. Después de la infiltración al vacío en la oscuridad durante 30 minutos (Figura 2B), mantenga las tiras de hojas de repollo sumergidas en la solución enzimática (Figura 2C) en la oscuridad a temperatura ambiente durante 4-16 h más.
   NOTA: El tiempo de digestión enzimática puede variar entre los cultivares de repollo y debe optimizarse de acuerdo con el genotipo específico. Por ejemplo, 'Fuyudori' requiere un tiempo de digestión más largo (16 h) en comparación con '228' (4 h) debido a las hojas más gruesas de 'Fuyudori'.
4. Diluir la solución que contiene protoplastos con un volumen igual de solución W5, que consta de 2 mM de MES (pH 5,7), 154 mM de NaCl, 125 mM de CaCl₂, 5 mM de KCl y 5 mM de glucosa (consulte la Tabla 1 para la preparación), para detener la digestión enzimática.
5. Libere la suspensión de protoplast girándola suavemente o utilizando un agitador orbital. Filtre la suspensión celular a través de un filtro celular de 70 μm en un tubo cónico de 50 mL.
   NOTA: Los protoplastos aislados son capaces de pasar a través de un filtro de células de 70 μm, mientras que los restos vegetales no digeridos son retenidos por el filtro y posteriormente eliminados de la suspensión. Los filtros celulares se pueden reutilizar y mantener en etanol al 75% después del lavado, pero es necesario enjuagar completamente los filtros celulares con solución W5 para eliminar el etanol residual antes de su uso.
6. Centrifugar la solución de protoplastos con 150 x g durante 2 min a 4 °C y, a continuación, retirar con cuidado el sobrenadante. Lave suavemente los protoplastos peletizados añadiendo 10 mL de solución W5 a lo largo de la pared del tubo cónico a un caudal aproximado de 1 mL·^s-1. Centrifugar el tubo a 150 x g durante 2 min a 4 °C y repetir de nuevo este procedimiento de lavado para asegurar la eliminación completa de la solución enzimática.
7. Vuelva a suspender los protoplastos en la solución W5 y colóquelos en hielo durante 30 minutos. Después de la incubación del hielo, retire el sobrenadante con una pipeta de 1 ml a la vez hasta que se elimine todo el sobrenadante.
8. Vuelva a suspender los protoplastos en una solución de MMG preenfriada con hielo compuesta por 4 mM de MES (pH 5,7), 0,4 M de manitol y 15 mM de MgCl₂ (ver Tabla 1 para la preparación).
9. Mida la concentración de protoplastos con un hemocitómetro y ajuste la concentración final a 4 x 10⁵ protoplastos·^mL-1 utilizando solución de MMG.

3. Transfección de protoplastos

1. Mezclar un volumen total de 10 μL de plásmido (5-10 μg) (Ficha Suplementaria 1) con 100 μL de protoplastos (4 x 10⁴ protoplastos) y colocar en hielo durante 10 min.
   NOTA: Para la purificación de plásmidos de grado de transfección, se utiliza un kit de plásmidos disponible en el mercado siguiendo las instrucciones del fabricante. Aproximadamente 4 x 10⁴ protoplastos se emplean típicamente en un ensayo reportero de luciferasa dual. Para experimentos a mayor escala, se dispone de una mayor cantidad de protoplastos para la transfección. Específicamente, alrededor de 2 x 10⁵ protoplastos transfectados con 10 μg de plásmido exhiben una eficiencia de transfección probada que oscila entre el 30% y el 40%.
2. Añada un volumen igual (110 μL) de solución de PEG recién preparada (consulte la Tabla 1 para la preparación) que contenga un 40% de polietilenglicol 4000 (PEG4000), 0,1 M de CaCl₂ y 0,2 M de manitol en la solución de protoplast y mezcle suavemente.
3. Incubar la mezcla de protoplast a temperatura ambiente en la oscuridad durante 10 minutos, luego agregar 440 μL de solución W5 para terminar la reacción.
4. Centrifugar los protoplastos transfectados a 150 x g durante 2 min a 4 °C y resuspender el pellet en 750 μL de solución W5 enriquecida con oxígeno. Transfiera los protoplastos resuspendidos a una placa de cultivo de tejidos de 6 pocillos prerrecubierta con BSA al 1%.
   NOTA: La solución W5 utilizada para la incubación celular debe burbujearse con oxígeno utilizando un concentrador de oxígeno (~90% de oxígeno) conectado a una piedra difusora durante 5 minutos (Figura 2D). Después de este proceso de oxigenación, la concentración final de oxígeno disuelto en la solución W5 aumentó de 7,84 mg· ^L-1 ± 0,05 mg· ^L-1 a 29.18 mg· ^L-1 ± 0,43 mg· ^L-1, medido con un medidor de oxígeno disuelto. El volumen de la solución W5 para la resuspensión del protoplasto transfectado depende del tipo de placa de cultivo celular de tejidos utilizada. Para placas de cultivo celular de 12 o 24 pocillos, es aconsejable reducir el volumen de la solución W5 para mitigar el estrés por hipoxia durante la incubación debido a la mayor profundidad dentro de los pocillos. Para el recubrimiento de BSA, cada pocillo de la placa de cultivo recibió 1 mL de solución de BSA al 1%, que se dejó recubrir los pocillos durante 10 s. A continuación, la solución BSA se desechó de cada pozo, y los pozos se rellenaron posteriormente con solución W5. Este procedimiento tuvo como objetivo crear una superficie temporal no adherente utilizando BSA, evitando eficazmente que los protoplastos se adhirieran a la superficie plástica de la placa de cultivo durante las etapas experimentales posteriores.

4. Tratamiento de la hipoxia en los protoplastos de la col

1. Llevar a cabo tratamientos de hipoxia química o físicamente inducida inmediatamente después de la transfección de protoplasto.
   NOTA: Se recomienda que el tratamiento de la hipoxia se aplique inmediatamente después de la transfección del protoplasto. La incubación prolongada de los protoplastos puede disminuir la respuesta posterior a la hipoxia.
   1. Para la hipoxia inducida químicamente en los protoplastos de la col, agregue OxyFluor, EC-Oxyrasa y sulfito de sodio a la solución de protoplastos W5.
      NOTA: El uso de 0,6 unidades·^mL-1 de EC-oxirasa, 0,6 unidades·^mL-1 de OxyFluor y 1 g·^mL-1 de sulfito de sodio en W5 fueron las condiciones probadas capaces de inducir el promotor de BoADH1 y BoSUS1L (Figura 3A) con bajo daño a la integridad del protoplasto en las dos variedades de repollo examinadas.
   2. Para la hipoxia inducida por la bolsa que consume oxígeno, coloque dos paquetes de absorción de oxígeno en un frasco anaeróbico de 3,5 L para crear un ambiente hipóxico.
2. Cosechar los protoplastos tratados con hipoxia centrifugando a 150 x g durante 2 min a 4 °C. Congele los protoplastos recogidos con nitrógeno líquido y guárdelos en un congelador a -80 °C para ensayos posteriores.

5. Ensayo de luciferasa dual

1. Realice el ensayo reportero de luciferasa dual de acuerdo con las instrucciones del fabricante con pequeñas modificaciones.
   1. Vuelva a suspender los protoplastos de repollo en 50 μL de 1x tampón de lisis pasiva y vórtice durante 10 s.
   2. Incubar los protoplastos interrumpidos en hielo durante 10 min y recoger el sobrenadante después de la centrifugación a 10.000 x g durante 10 min a 4 °C.
   3. Añadir 20 μL de lisado celular a cada pocillo de la microplaca. Dispense 100 μL de reactivo de ensayo de luciferasa II en los pocillos y mida la actividad de la luciferasa de luciferasa de luciérnaga utilizando un lector de microplacas.
   4. Añada 100 μl del reactivo de ensayo disponible en el mercado a cada pocillo y mida la actividad de la Luciferasa Renilla utilizando un lector de microplacas.

Resultados

Este trabajo desarrolló con éxito un sistema de expresión transitoria utilizando protoplastos de repollo (consulte la Figura 1 para el flujo de trabajo). Los protoplastos se aislaron de hojas verdaderas de repollo de 2 a 3 semanas de edad de tamaño apropiado (Figura 2A) de los cultivares comerciales de repollo 'Fuyudori' y '228' utilizando digestión con celulasa/macerozima e infiltración al vacío oscuro (

Discusión

Este protocolo presenta un método simplificado para el aislamiento de protoplastos de dos cultivares comerciales de repollo. La eficacia de este método se evalúa principalmente a través de dos parámetros críticos de control de calidad: el rendimiento de protoplastos viables y la eficiencia de la transfección de protoplastos. La implementación de este protocolo dio como resultado un rendimiento superior a 4.00 x 10⁶ protoplastos·g⁻¹· FW del tejido mesófi...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-(N-morpholino) ethanesulfonic Acid (MES)	PhytoTech Labs	M825	For enzyme solution preparation
228 cabbage seeds	Takii & Co., Ltd. (Kyoto, Japan)
50 mL Conical Tube	SPL Life Sciences	50050	For enzyme solution preparation
6-well tissue culture plate	Alpha Plus	16106	For protoplast incubation
70 μm cell strainer	Sorfa	SCS701	For protoplast filtration
9-cm Petri dish	Alpha Plus	16001	For enzymatic digestion
Anaerobic jar	HIMEDIA	Anaerobic Jar 3.5 L	For hypoxia treatment
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A7906	For W5 solution preparation and culture plate coating
Calcium chloride	J.T.Baker	131301	For W5 solution and PEG solution preparation
Cellulase R10	Yakult		For enzyme solution preparation
Desiccator	Tarsons	402030	For vacuum infiltration
D-Glucose	Bioshop	GLU501	For W5 solution preparation
Dissolved oxygen meter	Thermo Scientific	Orion Star A223	For oxygen measurement
D-Mannitol	Sigma-Aldrich	M1902	For enzyme solution, PEG solution, and MMG solution preparation
Dual-Luciferase Reporter Assay System	Promega	E1960	For Dual-luciferase reporter assay
EC-Oxyrase	Oxyrase Inc.	EC-0005	For hypoxia treatment
Fuyudori cabbage seeds	Kobayashi Seed Co., Ltd. (Kakogawashi, Japan)
High-Speed refrigerated centrifuge	Hitachi	CR21GIII	For protoplast harvest
Macerozyme R10	Yakult		For enzyme solution preparation
Magnesium chloride	Alfa Aesar	12315	For MMG solution preparation
Microcentrifuge	Hitachi	CT15RE	For protoplast harvest
Microplate	Greiner	655075	For Dual-luciferase reporter assay
Microplate Reader	Molecular Devices	SpectraMax Mini	For Dual-luciferase reporter assay
Millex 0.22 μm syringe filter	Merck	SLGP033RS	For enzyme solution preparation
Oil Free Vacuum Pump	Rocker	Rocker 300	For vacuum infiltration
OxyFluor	Oxyrase Inc.	OF-0005	For hypoxia treatment
Oxygen absorber pack	Mitsubishi Gas Chemical Company	AnaeroPack, MGCC1	For hypoxia treatment
Oxygen concentrator	UTMOST PERFECT	AII-X	For oxygen-bubbling in W5 solution
Plant substrate	Klasmann-Deilmann	Potgrond H substrate	For cabbage seedlings preparation
Plasmid Midi Kit	QIAGEN	12145	For purification of transfection-grade plasmid DNA
Polyethylene Glycol 4000	Fluka	81240	For protoplast transfection
Potassium chloride	J.T.Baker	304001	For W5 solution preparation
Razor blade	Gillette		For cabbage leaf strips preparation
Sodium chloride	Bioshop	SOD002	For W5 solution preparation
Sodium sulfite	Sigma-Aldrich	S0505	For hypoxia treatment
Water Bath	Yihder	BU-240D	For enzyme solution preparation