Prueba de eficiencia de traslación utilizando perfiles de polisomas bajo estrés térmico

Resumen

El protocolo presentado aquí implica el perfil polisomal para aislar translatoma, ARNm asociados con ribosomas, en ARN polisomales y no polisomales de Arabidopsis a través de la centrifugación en gradiente de densidad de sacarosa. Este método demuestra la eficiencia de traslación de Arabidopsis sometida a estrés térmico.

Resumen

El control traslacional de diferentes genes bajo estrés térmico es un paso crítico para la adaptación de las plantas al medio ambiente. La evaluación de las actividades traslacionales de varios genes puede ayudarnos a comprender los mecanismos moleculares que subyacen a la resiliencia de las plantas, contribuyendo al desarrollo de cultivos con mayor tolerancia al estrés frente al cambio climático global. Este artículo presenta una metodología detallada para evaluar la eficiencia de la traslación a través del perfil de polisomas en plantas expuestas a estrés térmico. El procedimiento se divide en tres partes: tratamiento de estrés térmico para Arabidopsis, prueba de eficiencia de traducción utilizando perfiles de polisomas y cálculo de la eficiencia de traducción mediante el aislamiento de ARN polisomal y no polisomal basado en el perfil. En la primera parte, las plantas de Arabidopsis se someten a condiciones controladas de estrés térmico para imitar los desafíos ambientales. El tratamiento consiste en exponer las plantas a altas temperaturas durante períodos específicos, lo que garantiza una inducción de estrés constante y reproducible. Este paso es crucial para estudiar las respuestas fisiológicas y moleculares de la planta al estrés por calor. La segunda parte consiste en la prueba de eficiencia de traducción utilizando perfiles de polisomas. Los polisomas se extraen mediante centrifugación en gradiente de sacarosa, que separa los ARNm en función de la carga ribosómica. Esto permite examinar la ocupación de los ribosomas en los ARNm, proporcionando información sobre los mecanismos de control de la traducción en condiciones de estrés. En la tercera parte, el ARN se aísla de fracciones polisomales y no polisomales. El ARN de pico se utiliza para medir con precisión la cantidad de ARN en cada fracción. El cálculo de la eficiencia de traducción se realiza comparando la distribución de los ARNm a través de estas fracciones en condiciones normales y de estrés térmico. Las actividades de traducción de genes específicos se evalúan aún más mediante la realización de PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR) con ARN asociado a ribosoma y ARN total. Esta metodología se centra exclusivamente en los efectos del estrés térmico, proporcionando un protocolo detallado para analizar la regulación traslacional en las plantas.

Introducción

La traducción es crucial para que los organismos sinteticen proteínas funcionales a partir de ARNm, apoyando las funciones celulares esenciales y los procesos biológicos como el metabolismo y la señalización y permitiendo las respuestas al estrés. Sin traducción, las células no pueden producir proteínas vitales, lo que afecta su estructura, función y regulación, lo que afecta el mantenimiento de la vida y fomenta la diversidad biológica ^1,2. Por lo tanto, el estudio de la eficiencia traslacional de las plantas es crucial. La traducción implica varios pasos esenciales. En prime....

Protocolo

1. Preparación de muestras de plántulas de Arabidopsis tratadas con estrés térmico

1. Placa de 250 semillas para cada réplica y cada condición con un gotero en el papel de filtro colocado en la placa de agar medio basal Murashige y Skoog (MS) sin sacarosa (pH 5,6) suplementada con fitoagar al 1,2%.
   NOTA: Para plantar plántulas en placas MS, se coloca papel de filtro estéril en la placa para evitar que las raíces de las plántulas penetren profundamente en el medio, lo que facilita el muestreo. A continuación, las semillas se plantan sobre el papel de filtro. Para ex....

Resultados

El tipo silvestre de Arabidopsis, Col-0, se cultivó en medio MS bajo un fotoperiodo de luz de 16 h:8 h. Para el control, se utilizaron plántulas de 5 días de edad sin tratamiento de estrés térmico. El grupo de estrés térmico se sometió a 1 h de tratamiento térmico a 40 °C en un baño de agua precalentado, mientras que el grupo de recuperación se colocó a 22 °C durante 2 h inmediatamente después del tratamiento térmico. Al emplear diferentes condiciones de tratamie.......

Discusión

Este protocolo describe un método sencillo y estandarizado para medir la eficiencia de traducción de las plántulas de Arabidopsis. Los pasos críticos de este protocolo son garantizar la estabilidad del ARN con centrifugación secundaria y extracción de ARN, extracción con reactivos, así como una preparación meticulosa del gradiente de sacarosa. Además, proporcionamos pasos críticos para normalizar y cuantificar el ARN polisomal y no polisomal con el método de normalización de.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL eppendorf tube	Labcon	3012-870-000-9	RNA extraction
13.2 mL centrifuge tube	Beckman Coulter	331372	ultracentrifugation
Bromophenol blue	Honeywell	32712	Polysome profile
Chloroform	Honeywell	32211	RNA extraction
Cycloheximide (CHX)	Sigma-Aldrich	SI-C7698	Polysome profile
Diethyl pyrocarbonate (DEPC)	Sigma-Aldrich	D5758	RNA extraction
Ethanol	Sigma-Aldrich	32221	RNA extraction
GeneChip Eukaryotic Poly-A RNA Control Kit	Invitrogen	900433	Normalization
Glycerol	Honeywell	15523	Normalization
Heparin	Sigma-Aldrich	SI-H3149	Polysome profile
HiScript III RT SuperMix for qPCR kit	Vazyme	R323-01	Normalization
KCl	J.T.Baker	3040-01	Polysome profile
MgCl2	Sigma-Aldrich	SI-M8266	Polysome profile
MS basal medium	Phyto	M524	Plant culture
Peak Chart Syringe Pump	Brandel	SYN4007LS	Polysome profile
Polyoxyethylene-10-Tridecyl-Ether (PTE)	Sigma-Aldrich	P2393	Polysome profile
RNasin	Promega	N251B	Polysome profile
Sodium deoxycholate (DOC)	Sigma-Aldrich	SI-D6750	Polysome profile
Sucrose	Sigma-Aldrich	S5391	Polysome profile
SYBR Green Supermix	Bio-Rad	BP170-8882	Normalization
TRI reagent	MRC	TR118	RNA extraction
Tris-HCl	J.T.Baker	4109-06	Polysome profile
Ultracentrifuge	Beckman Coulter	Optima L-100K	ultracentrifugation
UV/VISDETECTOR	Brandel	UA-6	Polysome profile