Prueba de eficiencia de traslación utilizando perfiles de polisomas bajo estrés térmico

Resumen

El protocolo presentado aquí implica el perfil polisomal para aislar translatoma, ARNm asociados con ribosomas, en ARN polisomales y no polisomales de Arabidopsis a través de la centrifugación en gradiente de densidad de sacarosa. Este método demuestra la eficiencia de traslación de Arabidopsis sometida a estrés térmico.

Resumen

El control traslacional de diferentes genes bajo estrés térmico es un paso crítico para la adaptación de las plantas al medio ambiente. La evaluación de las actividades traslacionales de varios genes puede ayudarnos a comprender los mecanismos moleculares que subyacen a la resiliencia de las plantas, contribuyendo al desarrollo de cultivos con mayor tolerancia al estrés frente al cambio climático global. Este artículo presenta una metodología detallada para evaluar la eficiencia de la traslación a través del perfil de polisomas en plantas expuestas a estrés térmico. El procedimiento se divide en tres partes: tratamiento de estrés térmico para Arabidopsis, prueba de eficiencia de traducción utilizando perfiles de polisomas y cálculo de la eficiencia de traducción mediante el aislamiento de ARN polisomal y no polisomal basado en el perfil. En la primera parte, las plantas de Arabidopsis se someten a condiciones controladas de estrés térmico para imitar los desafíos ambientales. El tratamiento consiste en exponer las plantas a altas temperaturas durante períodos específicos, lo que garantiza una inducción de estrés constante y reproducible. Este paso es crucial para estudiar las respuestas fisiológicas y moleculares de la planta al estrés por calor. La segunda parte consiste en la prueba de eficiencia de traducción utilizando perfiles de polisomas. Los polisomas se extraen mediante centrifugación en gradiente de sacarosa, que separa los ARNm en función de la carga ribosómica. Esto permite examinar la ocupación de los ribosomas en los ARNm, proporcionando información sobre los mecanismos de control de la traducción en condiciones de estrés. En la tercera parte, el ARN se aísla de fracciones polisomales y no polisomales. El ARN de pico se utiliza para medir con precisión la cantidad de ARN en cada fracción. El cálculo de la eficiencia de traducción se realiza comparando la distribución de los ARNm a través de estas fracciones en condiciones normales y de estrés térmico. Las actividades de traducción de genes específicos se evalúan aún más mediante la realización de PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR) con ARN asociado a ribosoma y ARN total. Esta metodología se centra exclusivamente en los efectos del estrés térmico, proporcionando un protocolo detallado para analizar la regulación traslacional en las plantas.

Introducción

La traducción es crucial para que los organismos sinteticen proteínas funcionales a partir de ARNm, apoyando las funciones celulares esenciales y los procesos biológicos como el metabolismo y la señalización y permitiendo las respuestas al estrés. Sin traducción, las células no pueden producir proteínas vitales, lo que afecta su estructura, función y regulación, lo que afecta el mantenimiento de la vida y fomenta la diversidad biológica ^1,2. Por lo tanto, el estudio de la eficiencia traslacional de las plantas es crucial. La traducción implica varios pasos esenciales. En primer lugar, la iniciación se produce cuando el ARNm se une a un ribosoma, facilitada por factores de iniciación como los eIFs en eucariotas, que identifican el codón de inicio, normalmente AUG. A continuación, la elongación procede a medida que las moléculas de ARN de transferencia (ARNt), cada una de las cuales lleva aminoácidos específicos, se unen secuencialmente al ribosoma. Los enlaces peptídicos se forman entre los aminoácidos adyacentes, alargando la cadena polipeptídica de acuerdo con la secuencia de ARNm. Finalmente, la terminación se inicia al encontrar un codón de parada (UAA, UAG o UGA), reconocido por factores de liberación que incitan al ribosoma a liberar la proteína recién sintetizada. A lo largo de la traducción, varios factores de iniciación eucariotas (eIF), factores de elongación y ARN ribosómicos trabajan juntos para garantizar la precisión y la eficiencia ^3,4.

Estudios previos han indicado que las modificaciones postraduccionales desempeñan un papel fundamental en la regulación de las interacciones entre los eIFs y, por lo tanto, influyen en la eficiencia de la traducción. La investigación in vitro ha revelado que la quinasa CASEÍNA quinasa 2 (CK2) fosforila eIF3c, eIF5 y eIF2β para aumentar sus interacciones entre sí y con eIF1 ^5,6. En la oscuridad, la ligasa E3 CONSTITUTIVAMENTE FOTOMORFOGÉNICA 1 (COP1) reprime la traducción mediante la inhibición de la fosforilación mediada por TOR de S6K-RPS6. El RPS6 no fosforilado es incapaz de formar ribosomas funcionales, deteniendo así la traducción⁷. Por el contrario, en condiciones de luz, la quinasa SUPPRESSOR OF PHYA 105 (SPA1) fosforila eIF2α para facilitar el ensamblaje del complejo eIF2 y promover el inicio de la traducción⁸. Estos hallazgos ponen de manifiesto los complejos mecanismos de control que regulan la traducción en respuesta a las señales ambientales.

Los estímulos ambientales moderados pueden promover eficazmente procesos traslacionales para facilitar el crecimiento, como la fotomorfogénesis ^8,9. Sin embargo, cuando los factores ambientales son excesivos, las plantas inmóviles necesitan desarrollar mecanismos regulatorios adecuados para mitigar los daños causados por el estrés ambiental¹⁰. En estudios previos relacionados con las respuestas al estrés de las plantas, la mayoría se centró en la regulación a nivel metabólico, hormonal y transcripcional 11,12,13,14. Sin embargo, investigaciones recientes han comenzado a destacar la influencia de la regulación traslacional en la tolerancia al estrés de las plantas 15,16,17. Las plantas pueden aumentar su tolerancia al estrés reduciendo la eficiencia de traslación, minimizando así el consumo innecesario de energía. Debido a la formación de gránulos de estrés no membranosos en las células vegetales, el ARNm no traducido y las proteínas asociadas se agregan dentro de ellos para reducir la eficiencia traduccional¹⁸. Uno de los estreses ambientales comunes que las plantas encuentran a menudo es el estrés por calor, que se ha reportado que induce la formación de gránulos de estrés dentro de las células vegetales^19,20. El aumento global de las temperaturas medias debido al calentamiento global afecta gravemente el rendimiento de los cultivos²¹. Por lo tanto, el estudio de la regulación fisiológica de las plantas bajo estrés térmico es crucial. Un estudio anterior ha demostrado que el tratamiento térmico del trigo dio lugar a una disminución del ARNm unido a polisomas. Sin embargo, los ARNm almacenados en gránulos de estrés se liberaron y se volvieron a unir a los ribosomas, lo que facilitó la traducción después de la recuperación²². Además, investigaciones anteriores han comparado la expresión génica entre el ARNm total y el ARNm unido a polisomas en plantas sumergidas¹⁶. Los resultados indicaron que los niveles de ARNm en estado estacionario asociados con el ácido abscísico y las respuestas de estrés abiótico aumentaron ligeramente después de la inmersión. Además, la cantidad de ARNm unidos a polisomas aumentó significativamente. Estos resultados sugieren que la regulación de la traslación podría desempeñar un papel más crítico en el control de la tolerancia al estrés en las plantas. Por lo tanto, un método eficaz de aislamiento de ARN polisomal es crucial para estudiar el translatomo de muestras tratadas bajo estrés.

En este protocolo, modificamos el método de aislamiento de ARN de la extracción de fenol/cloroformo voluminoso y de alto riesgo con el método de precipitación de LiCl al método de extracción de fenol/tiocianato de guanidinato a pequeña escala, que requiere menos volumen. El primer método consiste en la mezcla directa con fracciones polisomales, lo que resulta en un residuo experimental de mayor tamaño ^9,15,23. Por el contrario, este enfoque modificado utiliza principios de densidad diferencial: el ARN polisomal se mezcla primero con una solución sin azúcar con alto contenido de sal y luego se precipita por ultracentrifugación. Posteriormente, la extracción del ARN se realiza utilizando un pequeño volumen de reactivo de tiocianato de fenol/guanidinio. Este método reduce eficazmente la generación de residuos orgánicos, lo que hace que nuestro experimento sea más respetuoso con el medio ambiente. Además, los disolventes orgánicos utilizados tienen una menor toxicidad. Estas razones nos llevaron a ajustar y mejorar los procedimientos experimentales en consecuencia. Además, los métodos anteriores no proporcionaban un protocolo completo para calcular la eficiencia de la traducción mediante la normalización de picos de entrada, que es esencial para análisis translatómicos más profundos.

Aquí, describimos el perfil de polisomas y el protocolo de aislamiento de ARN polisomal para investigar la eficiencia de la traducción y los análisis translatómicos en Arabidopsis bajo estrés de choque térmico. Este protocolo se empleó para evaluar la eficiencia de la traslación en el tipo salvaje Col-0 en condiciones normales, de choque térmico y posteriores a la recuperación. Los resultados del perfil de polisomas y el porcentaje de ARN polisomal revelaron alteraciones en la eficiencia de traducción después del tratamiento de estrés térmico en plántulas de Arabidopsis .

Protocolo

1. Preparación de muestras de plántulas de Arabidopsis tratadas con estrés térmico

1. Placa de 250 semillas para cada réplica y cada condición con un gotero en el papel de filtro colocado en la placa de agar medio basal Murashige y Skoog (MS) sin sacarosa (pH 5,6) suplementada con fitoagar al 1,2%.
   NOTA: Para plantar plántulas en placas MS, se coloca papel de filtro estéril en la placa para evitar que las raíces de las plántulas penetren profundamente en el medio, lo que facilita el muestreo. A continuación, las semillas se plantan sobre el papel de filtro. Para excluir la influencia de los azúcares en el crecimiento de las plantas y los resultados experimentales, se recomienda utilizar un medio MS que no contenga sacarosa para el cultivo.
2. Envuelva la placa MS que contiene las semillas plantadas con papel de aluminio para bloquear la luz e incube a 4 °C durante 2 días para inducir la vernalización.
3. Transfiera las semillas vernalizadas a una cámara de crecimiento para cultivar bajo un fotoperíodo claro-oscuro de 16 h: 8 h a 22 °C con una intensidad de luz de 100 μmol/m²/s.
4. Para muestras de estrés térmico, selle las placas de MS medium que contienen plántulas de 5 días con cinta adhesiva impermeable y colóquelas en un baño de agua a 40 °C durante 1 h.
5. Para las muestras que se recuperan después del tratamiento térmico, enfríe las placas inmediatamente después del tratamiento térmico. Posteriormente, colóquelos en una cámara de crecimiento a 22 °C durante 2 h.
6. Coseche 250 plántulas tratadas o sin tratar en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml para cada réplica y congele las muestras en nitrógeno líquido inmediatamente.
   NOTA: Para cada condición, se prepararon dos grupos de muestras. Uno es para los análisis de perfiles de polisomas y el otro es para la extracción de ARN polisomal y no polisomal.

2. Preparación del gradiente de sacarosa

1. Prepare la solución de gradiente que contenga las siguientes concentraciones de sacarosa: 12,5 %, 24,4 %, 36,3 %, 48,1 % y 60 %. La composición de la solución incluye 50 mM de Tris-HCl, 25 mM de KCl, 10 mM de MgCl₂, 100 μg/mL de heparina y 50 μg/mL de cicloheximida (CHX).
2. Cargue las soluciones de gradiente de alta a baja concentración, comenzando desde la parte inferior y moviéndose hacia arriba. Después de agregar cada concentración de solución de gradiente, congele la solución a un estado sólido antes de agregar la siguiente concentración. Para cada concentración de gradiente de sacarosa, agregue 2.2 mL. Este proceso dará como resultado un gradiente discontinuo de densidad de sacarosa.
3. Almacene temporalmente el gradiente de sacarosa preparado a -80 °C y descongele durante la noche a 4 °C antes de usar.

3. Preparación de muestras de perfilado de polisomas

1. Muele 250 plántulas de Col-0 de 5 días de edad, estresadas por calor o sin tratar, que hayan sido previamente congeladas hasta convertirlas en polvo utilizando un homogeneizador a una frecuencia de 30 ciclos/s durante 1 min.
   NOTA: Cuando el número de plantas con el mismo fondo es igual, tienen el mismo rendimiento de extracción de ARN. Sin embargo, cuando se comparan plantas transgénicas o mutantes con sobreexpresión con diferentes antecedentes, la cantidad de plantas utilizadas debe ajustarse de acuerdo con las condiciones de la planta.
2. Para obtener una solución de extracción que contenga ARN polisomal y no polisomal, agregue 500 μL de tampón de extracción de polisomas (200 mM de Tris-HCl, pH 8.0, 50 mM de KCl, 25 mM de MgCl₂, 50 μg/mL de cicloheximida, 100 μg/mL de heparina, 2% de PTE, 10% de DOC, 400 U/mL de inhibidor de la ribonucleasa) a cada tubo y mezcle las muestras invirtiendo y en vórtice. Asegúrese de que las muestras se mantengan a 4 °C durante todo el proceso.
3. Centrifugar la solución de extracción a 4 °C, 12.000 x g durante 10 min. A continuación, filtre el sobrenadante a través de un colador de células de 100 μm para obtener una solución de extracción clara y sin partículas.
   NOTA: Las partículas presentes en la solución de extracción pueden sedimentarse durante la ultracentrifugación, formando potencialmente una bolita que podría afectar la precisión de las mediciones de perfiles de polisomas.
4. Cargue el sobrenadante filtrado en un gradiente de sacarosa preparado previamente y asegúrese de que alcance el equilibrio.
   NOTA: Debido a la alta velocidad de rotación de la ultracentrífuga, es esencial garantizar tanto la seguridad como el correcto funcionamiento de la ultracentrífuga. Para lograr esto, es necesario confirmar que los pesos de la muestra sean idénticos antes de la rotación. Por lo tanto, utilizamos una balanza de precisión para verificar que los pesos de los gradientes sean completamente uniformes.
5. Centrifugar el gradiente de sacarosa cargado con muestras a 4 °C, 210.000 x g durante 3,5 h utilizando un rotor de cubo oscilante ultracentrífugo. Ajuste las tasas de aceleración y desaceleración al máximo. Después de la ultracentrifugación, el ARN polisomal y no polisomal se distribuye según su densidad en la solución de gradiente de sacarosa correspondiente.
   NOTA: En el gradiente de sacarosa, el ARN no polisomal con menor densidad se distribuye en la capa superior, mientras que el ARN polisomal, caracterizado por una mayor densidad debido a la presencia de numerosos ribosomas involucrados en la traducción activa del ARNm, se distribuye en la capa inferior. Posteriormente, el perfil de polisomas se puede medir utilizando un fraccionador de gradiente de densidad.

4. Análisis de perfiles de polisomas

NOTA: Se utiliza un fraccionador de gradiente de densidad con una bomba de jeringa de microvolumen para medir el perfil de polisomas.

1. Prepare la solución de persecución (70 % de sacarosa, 10 % de glicerol y 0,02 % de azul de bromofenol) para la bomba de jeringa de microvolumen.
2. Utilice software para controlar el fraccionador de gradiente de densidad. Calibrar la máquina con agua desionizada. Después de la calibración, utilícelo para realizar perfiles de polisomas.
   1. Para realizar el ajuste de la línea de base, encienda el UV/VISDetector hasta que la luz cambie de rojo a verde. Ajusta la perilla "Desplazamiento de la grabadora " para alinear la línea del marcador y, a continuación, gira la perilla " Ajuste de línea base" a la posición de apertura mínima. Coloque la perilla de sensibilidad en el detector UV/VISDETECTOR en el nivel 2.0 y presione el botón Auto Baseline . Finalmente, use la perilla de desplazamiento de la grabadora para ajustar la línea de base deseada a 20. El proceso de calibración variará en función de la marca del mecanismo y de las diferentes muestras.
3. Después de la ultracentrifugación, coloque los tubos con las muestras en el fraccionador de gradiente de densidad utilizando el sistema de perforación de tubos para que el tubo pueda conectarse a la bomba de jeringa con la solución de persecución y el detector UV.
4. Cambie el fraccionador de gradiente de densidad al modo de control por software (REMOTE) y ajuste el caudal de inyección de la bomba de jeringa de microvolumen a 3 mL/min.
5. Inicie la configuración del software para comenzar y obtener el gráfico del perfil de polisomas utilizando el fraccionador midiendo OD₂₅₄.

5. Aislamiento de ARN polisomal y no polisomal

NOTA: Para esta parte del protocolo, se utilizó un grupo diferente de muestras del mismo lote después de realizar la ultracentrifugación siguiendo los mismos pasos descritos anteriormente.

1. En función de los resultados de la medición del perfil de polisomas, recoja las fracciones de ARN polisomales y no polisomales por separado. Calcular los volúmenes de solución tanto para las fracciones polisomales como para las no polisomales y recoger la fracción no polisomal (parte superior).
   NOTA: De acuerdo con los perfiles, la fracción con más de dos ribosomas se define como una fracción polisomal, mientras que la fracción con los picos de ARNr 40S, 60S y 80S se define como una fracción no polisomal.
2. Mezcle bien las fracciones objetivo de ARN con una solución prefría 2x con alto contenido de sal (400 mM de Tris-HCl, pH 8,0, 100 mM de KCl, 50 mM de MgCl₂).
3. Añadir 8 μL de stock diluido de control de ARN poli-A eucariota del kit.
   NOTA: Para la normalización de picos necesaria para el séptimo paso. El kit de control de ARN poli-A eucariota incluye genes de B. subtilis , como el gen DAP que no están presentes en las plantas, como genes de referencia. Para determinar la proporción de pérdida de genes de referencia durante la reacción después de la extracción, agregue una cantidad igual del reactivo que contiene una muestra de ARN del gen DAP a diferentes tubos con ARN polisomal o no polisomal antes de la extracción. Esto permite determinar la proporción de pérdida de genes de referencia durante la reacción después de la extracción y se puede utilizar con fines de normalización.
4. Centrifugar el ARN mezclado en solución salina a 4 °C, 450.000 x g, durante 5 h utilizando un rotor de cubo oscilante ultracentrífugo.
5. Después de la ultracentrifugación, el ARN se precipitará en el fondo del tubo de centrífuga. Vierta con cuidado el sobrenadante desde arriba para preservar la bolita de ARN en la parte inferior.
6. Lave rápidamente el pellet de ARN con 500 μL de agua tratada con dietilpirocarbonato (DEPC) prefría, repitiendo este paso 3 veces.
   NOTA: Para evitar que el agua tratada con DEPC vuelva a disolver el ARN durante el proceso de lavado, es necesario enfriar previamente el agua tratada con DEPC antes de usarla para reducir su solubilidad. Además, se debe minimizar el tiempo de contacto entre el agua tratada con DEPC y el pellet de ARN durante el lavado.

6. Extracción de ARN polisomal y no polisomal

1. Añadir 500 μL de reactivo de extracción de ARN y mezclar con la muestra de ARN a extraer. Incubar durante 10 min.
2. Agregue 100 μL de cloroformo, mezcle bien e incube durante 10 minutos para la separación de fases.
3. Centrifugar la mezcla de reacción a 4 °C, 12.000 x g durante 10 min. Transfiera la capa acuosa transparente superior que contiene ARN a un nuevo tubo, mézclelo suavemente con un volumen igual de isopropanol e incube a -20 °C durante 2 h para la precipitación de ARN.
4. Después de la precipitación, centrifugar a 4 °C, 12.000 x g durante 10 min. Deseche con cuidado el sobrenadante y conserve la bolita de ARN en la parte inferior.
5. Lave el pellet de ARN con 1 mL de etanol prefrío al 75%. Centrifugar a 4 °C, 12.000 x g durante 10 min, desechar el sobrenadante y secar al aire el pellet de ARN.
6. Una vez que el pellet de ARN esté seco, vuelva a suspender el pellet de ARN en 30 μL de agua tratada con DEPC y mida la concentración de ARN (OD₂₆₀) utilizando un espectrofotómetro de espectro completo (220 nm-750 nm).

7. Normalización de picos

1. Utilice 1000 ng de ARN extraído para la transcripción inversa realizada mediante un kit de qPCR siguiendo las instrucciones del fabricante. Tanto el ARN polisomal como el no polisomal deben transcribirse de forma inversa en ADNc.
2. Mezcle 1 μL de ADNc con cebadores de genes DAP y use tampón SYBR para medir el nivel de expresión del gen objetivo según las instrucciones del fabricante. A continuación, utilice la PCR en tiempo real para detectar la expresión del gen DAP .
   NOTA: Las secuencias de los cebadores del gen DAP son las siguientes:
   Cebador delantero = 5'-ATA AAA GAA TTC AGC TAA CGC TTC C-3'
   Cebador inverso = 5'-TTG TTT CTT TGC CTC TAT TGT ATC C-3'
3. Comparar los niveles de expresión de los genes DAP en los grupos de ARN polisomal y no polisomal medidos y estimar el contenido de ARN en condiciones de pérdida proporcional. Usando el contenido de ARN normalizado, calcule la proporción de ARN en los polisomas.

Resultados

El tipo silvestre de Arabidopsis, Col-0, se cultivó en medio MS bajo un fotoperiodo de luz de 16 h:8 h. Para el control, se utilizaron plántulas de 5 días de edad sin tratamiento de estrés térmico. El grupo de estrés térmico se sometió a 1 h de tratamiento térmico a 40 °C en un baño de agua precalentado, mientras que el grupo de recuperación se colocó a 22 °C durante 2 h inmediatamente después del tratamiento térmico. Al emplear diferentes condiciones de tratamie...

Discusión

Este protocolo describe un método sencillo y estandarizado para medir la eficiencia de traducción de las plántulas de Arabidopsis. Los pasos críticos de este protocolo son garantizar la estabilidad del ARN con centrifugación secundaria y extracción de ARN, extracción con reactivos, así como una preparación meticulosa del gradiente de sacarosa. Además, proporcionamos pasos críticos para normalizar y cuantificar el ARN polisomal y no polisomal con el método de normalización de...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL eppendorf tube	Labcon	3012-870-000-9	RNA extraction
13.2 mL centrifuge tube	Beckman Coulter	331372	ultracentrifugation
Bromophenol blue	Honeywell	32712	Polysome profile
Chloroform	Honeywell	32211	RNA extraction
Cycloheximide (CHX)	Sigma-Aldrich	SI-C7698	Polysome profile
Diethyl pyrocarbonate (DEPC)	Sigma-Aldrich	D5758	RNA extraction
Ethanol	Sigma-Aldrich	32221	RNA extraction
GeneChip Eukaryotic Poly-A RNA Control Kit	Invitrogen	900433	Normalization
Glycerol	Honeywell	15523	Normalization
Heparin	Sigma-Aldrich	SI-H3149	Polysome profile
HiScript III RT SuperMix for qPCR kit	Vazyme	R323-01	Normalization
KCl	J.T.Baker	3040-01	Polysome profile
MgCl2	Sigma-Aldrich	SI-M8266	Polysome profile
MS basal medium	Phyto	M524	Plant culture
Peak Chart Syringe Pump	Brandel	SYN4007LS	Polysome profile
Polyoxyethylene-10-Tridecyl-Ether (PTE)	Sigma-Aldrich	P2393	Polysome profile
RNasin	Promega	N251B	Polysome profile
Sodium deoxycholate (DOC)	Sigma-Aldrich	SI-D6750	Polysome profile
Sucrose	Sigma-Aldrich	S5391	Polysome profile
SYBR Green Supermix	Bio-Rad	BP170-8882	Normalization
TRI reagent	MRC	TR118	RNA extraction
Tris-HCl	J.T.Baker	4109-06	Polysome profile
Ultracentrifuge	Beckman Coulter	Optima L-100K	ultracentrifugation
UV/VISDETECTOR	Brandel	UA-6	Polysome profile