Manipulación de fuerzas mecánicas en el corazón de pez cebra en desarrollo utilizando perlas magnéticas

Resumen

Este protocolo describe un método para injertar una perla magnética en el corazón del pez cebra en desarrollo a través de la microcirugía, lo que permite la manipulación de fuerzas mecánicas in vivo y desencadena la afluencia de calcio dependiente del estímulo mecánico en las células endocárdicas.

Resumen

Las fuerzas mecánicas proporcionan continuamente retroalimentación a los programas morfogenéticos de las válvulas cardíacas. En el pez cebra, el desarrollo de la válvula cardíaca depende de la contracción del corazón y de los estímulos físicos generados por el corazón latiendo. La hemodinámica intracardíaca, impulsada por el flujo sanguíneo, emerge como información fundamental que da forma al desarrollo del corazón embrionario. Aquí, describimos un método efectivo para manipular fuerzas mecánicas in vivo mediante el injerto de una perla magnética de 30 μm a 60 μm de diámetro en el lumen cardíaco. La inserción de la cuenta se lleva a cabo mediante microcirugía en larvas anestesiadas sin perturbar la función cardíaca y permite la alteración artificial de las condiciones límite, modificando así las fuerzas de flujo en el sistema. Como resultado, la presencia de la perla amplifica las fuerzas mecánicas experimentadas por las células endocárdicas y puede desencadenar directamente la afluencia de calcio dependiente de estímulos mecánicos. Este enfoque facilita la investigación de las vías de mecanotransducción que gobiernan el desarrollo del corazón y puede proporcionar información sobre el papel de las fuerzas mecánicas en la morfogénesis de la válvula cardíaca.

Introducción

Desde su introducción a finales de^{la década de} 1970, el pez cebra (Danio rerio) se ha convertido en un poderoso sistema modelo para estudiar las complejidades del desarrollo cardíaco y los trastornos cardíacos congénitos. A diferencia de la mayoría de los vertebrados, incluidos los embriones de ratón y pollo, que dependen de un sistema cardiovascular funcional y no pueden sobrevivir a los defectos cardíacos tempranos, el pez cebra proporciona una ventaja única al permitir la investigación de fenotipos cardíacos graves. Esto se debe a su pequeño tamaño, que facilita un suministro suficiente de oxígeno a....

Protocolo

Los procedimientos para trabajar con embriones de pez cebra descritos en este protocolo se adhieren a la directiva europea 2010/63/UE y a las directrices del Ministerio del Interior en virtud de la licencia de proyecto PP6020928.

1. Obtención de embriones de pez cebra para injerto de cuentas

1. Cruza la línea de pez cebra correspondiente y cultiva los embriones en el medio de Danieau a 28,5 °C. Para obtener instrucciones más detalladas sobre cómo cruzar líneas de pez cebra, consulte la Base de Datos de Educación Científica de JoVE²⁷.
2. Tratar los embr....

Discusión

Pasos críticos en el protocolo y solución de problemas

Montaje de embriones de pez cebra

La cantidad de agarosa utilizada para montar los embriones es importante. La cúpula formada no debe ser excesivamente grande, ya que esto puede dificultar la manipulación de la cuenta desde la superficie hasta los embriones. Por el contrario, no debe ser demasiado pequeño; Tener múltiples perlas e.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
Essential equipment for zebrafish raising, breeding, and embryo collection
Glass-bottom dish (35 mm x 15 mm)	VWR International	734-2905
Heat block	Eppendorf	EP5382000031	Eppendorf ThermoMixer C
Jewelers forceps	Sigma-Aldrich	F6521-1EA	Dumont No. 5, L 4 1/4 in., Inox alloy
Microcentrifuge tubes 2 mL	Eppendorf	30120094
Pasteur pipette
Petri dish
Stereomicroscope
Reagents
4 mg/mL tricaine stock solution
Danieau's medium (60x stock solution)
PureCube Glutathione MagBeads	Cube Biotech	32201
PTU (1-phenyl-2-thiourea)	Sigma-Aldrich	P7629
UltraPure low melting point agarose	Invitrogen	16520-050
Danieau's medium (60x stock solution)
34.8 g NaCl	Sigma-Aldrich	S3014
1.6 g KCl	Sigma-Aldrich	P9541
5.8 g CaCl2·2H2O	Sigma-Aldrich	C3306
9.78 g MgCl2·6H2O	Sigma-Aldrich	442611-M
Dissolve the ingredients in H2O to a final volume of 2 L. Adjust the pH to 7.2 using NaOH, then autoclave.
4 mg/mL tricaine stock solution
400 mg of tricaine powder (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt)	Sigma-Aldrich	A5040
97.9 mL double-distilled H2O
2.1 mL 1 M Tris (pH 9)
Adjust the pH to 7, then aliquot and store at -20 °C.