En el etiquetado in vitro de células estaminales embrionarias humanas de Resonancia Magnética

Resumen

En este vídeo, se muestra como etiqueta de células madre embrionarias humanas (células madre) con cloruro de manganeso (MnCl ₂) Que puede entrar en las células a través de los canales de calcio voltaje-dependientes cuando las células son biológicamente activos. Además, se muestra el uso de MnCl ₂ Como agente de cambio celular resonancia magnética para determinar la viabilidad de células madre in vitro de.

Resumen

Las células madre embrionarias (células madre) han demostrado la capacidad de restaurar el miocardio lesionado. La resonancia magnética (MRI) se ha convertido en una de las modalidades de imagen predominante para evaluar la restauración del miocardio lesionado. Por otra parte, ex-vivo agentes etiquetado, como las nanopartículas de óxido de hierro, se han empleado para rastrear y localizar las células madre trasplantadas. Sin embargo, este método no hace un seguimiento de una propiedad fundamental de la biología celular sobre la viabilidad de las células trasplantadas. Se ha sabido que el cloruro de manganeso _(MnCl2) entra en las células a través de voltaje de calcio (Ca ^{2 +)} de canal cuando las células son biológicamente activos, y se acumula intracelularmente para generar ^un efecto de acortamiento T. Por lo tanto, sugerimos que el manganeso guiada por resonancia magnética puede ser útil para controlar la viabilidad celular tras el trasplante de células madre de en el miocardio.

En este video, vamos a mostrar cómo etiquetar células madre con _MnCl2 y cómo esas células pueden verse claramente mediante el uso de resonancia magnética in vitro. Al mismo tiempo, la actividad biológica de Ca ^{2 +-los} canales serán moduladas utilizando tanto Ca ^{2 +-canal} de agonistas y antagonistas para evaluar los cambios concomitantes de la señal.

Protocolo

Etiquetado de manganeso de células estaminales embrionarias humanas

1. Trypsinize los tallos de embriones humanos que se han cultivado en el alimentador sin condiciones durante 5 minutos. Neutralizar la tripsina mediante la adición de medios de cultivo.
2. Vuelta a las células por centrifugación a 800 rpm durante 5 minutos a 20 ° Celsius. Después de volver a suspender el pellet de células, contar el número de células por tinción con azul tripán. Con base en el recuento de células obtenidas, las células se dividen en cuatro alícuotas de 3 millones de células en tubos cónicos. Precipitar las células por centrifugación de nuevo.
3. Justo antes de comenzar el etiquetado de manganeso, cloruro de manganeso se disuelven fresco con una solución de cloruro de sodio al 0,9% para hacer una solución 0,1 mM de cloruro de manganeso.
4. Con el fin de observar la actividad de los canales de calcio, cuatro muestras se prepararon. La primera muestra es de nuestro control, que contiene las células incubadas en el 0,9% de cloruro sódico solo. La segunda muestra contiene células incubadas en el 0,1 mM _MnCl2. Muestra 3 y 4 contienen las células se incubaron en mM MnCl 0,1 _2, ya sea con 5 mM de Ca ^{2 +-canal} agonista (s )-(-)- Bay K8644, o 250 M de la Ca ^{2 +-canal} antagonista verapamilo. Incubar las cuatro muestras a 37 ° C con 5% de CO ₂ durante 30 minutos.
5. Después de 30 minutos, centrifugar las células a 800 rpm durante 5 minutos a 20 ° Celsius. Y aspirar el sobrenadante y lavar las células marcadas dos veces con PBS. Después del lavado, vuelva a suspender cada pellet con 200 l de PBS y la transferencia en los tubos de PCR. Estas pastillas son generalmente de color blanco.

Etiquetado de hierro de las células estaminales embrionarias

1. Mix de grado clínico sulfato de protamina con agua destilada hasta obtener un 1 mg / ml de solución madre.
2. En un tubo madre de embriones humanos que contienen medio de cultivo celular, añadir ferumoxides a 100 mg / mL seguido por la adición de 12 mg / ml de sulfato de protamina. Mezcle la solución vigorosamente durante cinco minutos.
3. Añadir solución mixta a la misma cantidad de los medios de cultivo celular para lograr una concentración final de 50 mg / ml de ferumoxides y 6 mg / ml de sulfato de protamina a las células de la etiqueta. Se incuban las células en esta solución durante 12 horas.
4. Lavar las células dos veces con PBS, con el último lavado, que contiene heparina 10U/ml para disolver la matriz extracelular ferumoxides-protamina sulfato complejo. Después del lavado, trypsinize células para obtener una suspensión de células individuales.
5. Contar las células y la alícuota en el número requerido de muestras. Después del lavado, vuelva a suspender cada pellet con 200 l de PBS y la transferencia en los tubos de PCR. Estas pastillas deben ser de color marrón oscuro de color naranja.

Realización de imágenes por resonancia magnética celular

1. Hacer un fantasma con el fin de estabilizar los tubos que contienen los gránulos de las células y también para evitar los artefactos del aire circundante durante la exploración. Para ello, mezcla de 0,8% de agar y el 1% de sulfato de cobre en agua destilada y llevar a ebullición en el microondas durante 5-7 minutos. Enfriar esta mezcla por lo menos 1 hora antes de la exploración para obtener un gel.
2. Los tubos que contienen los gránulos de las células marcadas se coloca en el espectro para la exploración. Celular in vitro una resonancia magnética realizada en Signa HDx 3T MRI (GE Medical Systems) mediante el uso de la bobina de rodilla clínica.
3. Examinar las células de manganeso etiquetado para cada una de las tres muestras usando una secuencia de eco de espín: TR, el tiempo de repetición = 800 ms. TE: tiempo de eco = mínimo, FOV, campo de visión = 12 x 12 cm; matriz = 256x256, NEX 1.
4. Examinar las células de hierro etiquetados mediante el uso de una secuencia de eco de gradiente. Nosotros utilizamos los siguientes parámetros para esta imagen: TR = 100 ms, TE = 10 ms, FA, ángulo de inclinación = 30 °; FOV = 12 x 12 cm; matriz = 256 x 256, NEX 1.

Análisis de los resultados de la RM

1. Analizar las imágenes de resonancia magnética de 4 diferentes muestras de células de manganeso etiquetado:
   • Muestra # 1 es de nuestro control, que contiene las células incubadas en el 0,9% de cloruro sódico solo.
   • Muestra N ° 2 contiene las células incubadas en el 0,1 mM _MnCl2.
   • Muestra # 3 contiene las células incubadas en el 0,1 mM MnCl ₂ con 5 M de Ca ^{2 +-canal} agonista (s )-(-)- Bay K8644.
   • Muestra # 4 contiene las células incubadas en mM MnCl 0,1 ₂ con 250 M de la Ca ^{2 +-canal} antagonista verapamilo.
2. Como se predijo, las diferencias en la intensidad de señal de manganeso células marcadas son visibles. En comparación con las células marcadas únicamente con el manganeso, la intensidad de la señal con claridad el aumento de la presencia de los agonistas de los canales de calcio y disminuye en presencia de antagonistas de los canales de calcio. El área donde la intensidad de la señal se ha incrementado de manganeso células marcadas se miden mediante el uso de la imagen J (NIH, Bethesda, MD, EE.UU.). El mismo software se utiliza para analizar el área de la oscuridad fuera de resonancia de la señal del hierro células marcadas. El tamaño de la señal oscura de la plancha marcado células depende del número de células o el número de partículas de hierro contenido en las células. En este caso, Un millón de células muestra un área más pequeña de la señal oscura en comparación con la señal de los tres millones de células.

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Discusión

Estos resultados indican que el manganeso entra a través de los canales de calcio voltaje-dependientes, y el manganeso puede ser utilizado como agente de contraste MRI, que también puede mostrar la viabilidad de las células. Por lo tanto, sugerimos que el manganeso guiada por resonancia magnética puede ser útil para controlar la viabilidad celular después del trasplante de células madre embrionarias humanas en el miocardio.

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Manganese chloride tetrahydrate	Reagent	Sigma-Aldrich	M8054
(S)-(-)-Bay K8644	Reagent	Sigma-Aldrich	B133
(+)-Verapamil hydrochloride, minimum 99.0% titration	Reagent	Sigma-Aldrich	V4629
Sodium Chloride 0.85-0.90% W/V	Reagent	VWR international	VW 3257-1
Feridex I.V.	Reagent	Berlex Laboratories	NDC 59338-7035-5	ferumoxides injectable solution 11.2mg iron/mL
Protamine sulfate	Reagent	American Pharmaceutical Partners	NDC 63323-229-05	50 mg (10 mg/mL)
Knockout SR (Serum replacement for ES cells)	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	10828
DMEM/F12 (1:1)	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	11330
2- mercapt–thanol 98+%	Reagent	Sigma-Aldrich	M 3148
L-Glutamine 200mM 100x	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	25030
Penicillin-Streptomyocin 10,000 units/ml	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	15140-122
MEM Non-Essential Amino Acids 100x solution	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	11140
Signa HDx 3T MRI	Tool	GE Healthcare
clinical Knee coil	Tool	GE Healthcare
DPBS	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	14190