Paradigmas para la caracterización farmacológica de C. elegans mutantes transmisión sináptica

Resumen

Este video muestra cómo utilizar dos estimulantes neural, aldicarb y pentilentetrazol (PTZ), de manera complementaria para estudiar la función sináptica en el nematodo C. elegans. Con este enfoque complementario también puede ser utilizado para arrojar luz sobre los mecanismos conservado evolutivamente de sincronía neuronal modular y tiene implicaciones para la epilepsia y las convulsiones.

Resumen

El nematodo Caenorhabditis elegans, se ha convertido en un modelo de recurso para el estudio de la neurotransmisión. C. elegans es único entre los modelos animales, como la anatomía y la conectividad de su sistema nervioso se ha determinado a partir de microfotografías electrónicas y refinado por los ensayos farmacológicos. En este video, se describe cómo dos estimulantes complementarias neural, un inhibidor de la acetilcolinesterasa, llamado aldicarb, y un ácido gamma-aminobutírico (GABA), antagonista de los receptores, llamados pentilentetrazol (PTZ), puede ser empleado para caracterizar específicamente la señalización en C. elegans las uniones neuromusculares (NMJs) y facilitar la comprensión de los circuitos neuronales antagónicos.

De 302 neuronas de C. elegans, diecinueve GABAérgicas de tipo D de las neuronas motoras inervan los músculos de la pared del cuerpo (OCM), mientras que cuatro neuronas GABAérgicas, llamado MER, los músculos inervan la cabeza. Por el contrario, treinta y nueve neuronas motoras expresar el neurotransmisor excitador, la acetilcolina (ACh), y antagonizar la transmisión GABA en el OCM para coordinar la locomoción. La naturaleza antagónica de las neuronas motoras colinérgicas y GABAérgicas en el cuerpo NMJs muro fue determinado inicialmente por la ablación por láser y posteriormente reforzado por la exposición al aldicarb. Aguda de la exposición al aldicarb en una parálisis de tiempo-por supuesto-o la dosis de respuesta de tipo salvaje gusanos. Sin embargo, la pérdida de transmisión excitatoria ACh confiere resistencia a aldicarb, como menos ACh se acumula en NMJs gusano, que conduce a una menor estimulación de la OCM. La resistencia a aldicarb se puede observar con los mutantes función ACh-sean generales o específicos sináptica. De acuerdo con antagonistas GABA y la transmisión de acetilcolina, la pérdida de transmisión de GABA, o la incapacidad de regular negativamente la liberación de ACh, confiere hipersensibilidad al aldicarb. Aunque la exposición aldicarb ha conducido al aislamiento de los homólogos de los genes del gusano numerosos neurotransmisión, la exposición aldicarb por sí sola no puede determinar de manera eficiente las funciones predominantes de los genes y las vías en las neuronas específicas de C. elegans motor. Para ello, hemos introducido un enfoque complementario experimental, que utiliza PTZ.

Mutantes neurotransmisión mostrar fenotipos clara, distinta de la parálisis inducida por el aldicarb, en respuesta a PTZ. De tipo salvaje gusanos, así como mutantes con inhabilidades específicas para lanzar o recibir ACh, no muestran la sensibilidad evidente para PTZ. Sin embargo, los mutantes GABA, así como en general la función sináptica mutantes, mostrar convulsiones anterior en un tiempo-por supuesto-o la dosis de respuesta. Mutantes que no pueden regular negativamente la liberación de neurotransmisores en general y, por tanto, segregan cantidades excesivas de acetilcolina en OCM, se paralizan en el PTZ. Los fenotipos PTZ-inducida de las clases discretas mutantes indican que un enfoque complementario con aldicarb y paradigmas PTZ exposición en C. elegans puede acelerar nuestra comprensión de la neurotransmisión. Por otra parte, los videos que demuestran cómo llevamos a cabo ensayos farmacológicos deberían establecer métodos coherentes para C. elegans la investigación.

Protocolo

Aldicarb paradigma de la exposición

1. En el primer día, asegúrese de que al menos treinta gusanos jóvenes etapa adulta de cada genotipo y de cada repetición estará disponible para los ensayos de aldicarb en el segundo día. Lo mejor es que un experimentador selecciona cincuenta o más gusanos etapa L4 en placas NGM fresco (mejor sin nistatina), que contienen E. coli (preferiblemente OP50) como fuente de alimento y crecer durante 12-24 horas a una temperatura constante y permisiva (20 º C a 22 ° C es el mejor, aunque el 25 ° C está bien).
   
   
2. En el segundo día, hacer una solución de 100 mM de valores de aldicarb con un 70% de etanol (EtOH) y el 30% ddH ₂ O. Corre la cantidad apropiada de aldicarb en placas NGM menos nistatina con volúmenes definidos para alcanzar las concentraciones deseadas aldicarb. Estamos constantemente utilizan 0,5 mM aldicarb por la chapa del 37,5 l de 100 mM de aldicarb en 7,5 ml NGM placas. Permita que las placas de aldicarb se seque durante unos 30-60 minutos a temperatura ambiente. No es necesario para romper las tapas. Por otra parte, el aldicarb se puede agregar a NGM y almacenadas a 4 ° C durante una semana.
    
3. Después de los volúmenes de secado, placa uniforme de E. coli (preferiblemente OP50) en el centro de cada plato aldicarb y seco para otro 30-60 minutos a temperatura ambiente. Estamos constantemente placa 25 l de OP50, lo que crea un césped de alimentos suficientemente grande para mantener los gusanos se concentró en un pequeño punto sin hacinamiento.
    
4. Cuando el césped está seco de alimentos, se puede proceder con los ensayos de aldicarb. Debido a la naturaleza subjetiva de las pruebas de aldicarb, es muy recomendable que los experimentos se realizó "a ciegas". Un colega del investigador principal podría volver a etiquetar las placas originales con los gusanos que se vaya a analizar. Asimismo, el compañero puede transferir los gusanos de las placas originales de las placas aldicarb cifrados inmediatamente antes de iniciar un temporizador. Si el experimentador prevé ensayar una cepa particular de los gusanos con un fenotipo característico, como la falta de coordinación, entonces también debe haber un control con un fenotipo similar para reducir el sesgo. Además, lo mejor es que el experimentador ensayos de una cepa de tipo salvaje, así como una cepa resistente y una cepa hipersensible, en paralelo a ayudar a normalizar los experimentos. El experimentador debe esforzarse para analizar un número consistente de los gusanos para cada repetición. Estamos constantemente analizar treinta gusanos de un solo genotipo para cada repetición. También llevamos a cabo al menos tres réplicas para cada experimento. Un investigador experimentado debe ser capaz de analizar por lo menos seis cepas a la vez.
    
5. Cuente el número de gusanos paralizados por la insistencia de una manera consistente cada gusano con un alambre de platino. Constantemente nuestros productos gusanos dos veces en la cabeza y dos en la cola cada 30 minutos para un total de tres horas. Cese de la faringe de bombeo también se puede utilizar para definir la parálisis, pero sólo si el investigador emplea una definición coherente de la parálisis en todos los ensayos. Además, vale la pena señalar que algunos gusanos, especialmente aquellos que son resistentes a aldicarb, puede intentar gatear fuera del plato. En este caso, el experimentador puede extenderse la misma cantidad de ácido palmítico, una barrera física para la locomoción gusano, alrededor de las placas aldicarb. Difundimos 25 L de 10 mg de ácido palmítico / ml EtOH.

PTZ paradigma de la exposición

1. En el primer día, asegúrese de que al menos treinta gusanos jóvenes etapa adulta de cada genotipo y de cada repetición estará disponible para los ensayos de PTZ en el segundo día. Lo mejor es que un experimentador selecciona cincuenta o más gusanos etapa L4 en placas NGM fresco (mejor sin nistatina), que contienen E. coli (preferiblemente OP50) como fuente de alimento y crecer durante 12-24 horas a una temperatura constante y permisiva (20 º C a 22 ° C es el mejor, aunque el 25 ° C está bien).
   
   
2. En el segundo día, hacer un PTZ 0,5 g / ml de solución madre ddH ₂ O de PTZ. Corre la cantidad adecuada de PTZ en NGM menos placas de nistatina con volúmenes definidos para alcanzar las concentraciones deseadas PTZ. Porque preferimos dosis-respuesta para los ensayos de PTZ, que la placa de cantidades variables de PTZ en 7,5 ml NGM placas. Por ejemplo, una placa puede 37,5 l de la solución madre PTZ en un plato NGM 7,5 ml de hacer una 5 mg PTZ / ml de solución. Permita que las placas PTZ secar durante aproximadamente 60 a 120 minutos a temperatura ambiente. No es necesario para romper las tapas. Por otra parte, PTZ se puede agregar directamente a NGM, pero debe ser inmediatamente utilizado para los ensayos después de la solidificación. La estabilidad de PTZ es considerablemente menor que la de aldicarb. Por lo tanto, los ensayos con mayores placas PTZ son menos confiables. PTZ deben almacenarse a -20 ° C en un desecador con un agente de secado antes de su uso. Nosotros preferimos descartar PTZ aproximadamente dos meses después de la apertura para garantizar la estabilidad.
   
   
3. Después de los volúmenes de secado, placa uniforme de E. coli (preferiblemente OP50)en el centro de cada plato PTZ y seco para otro 30-60 minutos a temperatura ambiente. Estamos constantemente placa 25 l de OP50, lo que crea un césped de alimentos suficientemente grande para mantener los gusanos se concentró en un pequeño punto sin hacinamiento.
    
4. Cuando el césped está seco de alimentos, se puede proceder con los ensayos de PTZ. Aunque los ensayos de PTZ son menos subjetivos que los ensayos de aldicarb, todavía es muy recomendable que los experimentos se realizó "a ciegas". Un colega del investigador principal podría volver a etiquetar las placas originales con los gusanos que se vaya a analizar. Asimismo, el compañero puede transferir los gusanos de las placas originales de las placas PTZ cifrados inmediatamente antes de iniciar un temporizador. Si el experimentador prevé ensayar una cepa particular de los gusanos con un fenotipo característico, como la falta de coordinación, entonces también debe haber un control con un fenotipo similar para reducir el sesgo. Además, lo mejor es que el experimentador ensayos de una cepa de tipo salvaje, así como con las cepas anteriores, o de cuerpo entero convulsiones, en paralelo a ayudar a normalizar los experimentos. El experimentador debe esforzarse para analizar un número consistente de los gusanos para cada repetición. Estamos constantemente analizar treinta gusanos de un solo genotipo para cada repetición. También llevamos a cabo al menos tres réplicas para cada experimento. Un investigador experimentado debe ser capaz de analizar por lo menos tres cepas a la vez. Sin embargo, la frecuencia y la intensidad de las convulsiones inducidas por PTZ alcanzan su pico máximo entre los 15-30 minutos de exposición, y luego atenuar los gusanos se paralizan o, en algunos casos, se aclimate a la droga.
   
   
5. Cuente el número de "epilepsia-como" gusanos convulsiones cada 30 minutos para un total de una hora. Lo mejor es anotar el número de gusanos con convulsiones anterior, lo que llamamos "cabeza-bobs", independientemente de la cantidad de gusanos con convulsiones de todo el cuerpo, la parálisis de todo el cuerpo, lo que llamamos "tónico", o una combinación de convulsiones anterior con parálisis BWM, lo que llamamos "tónico-clónicas". La mayoría de los gusanos de un solo genotipo presentan sólo un tipo de convulsión. Sin embargo, tónico-clónicas gusanos a menudo se vuelven completamente tónica, por lo que se debe continuar con el ensayo de los últimos 30 minutos, incluso si todos los gusanos ya han expuesto convulsiones. Además, vale la pena señalar que algunos gusanos pueden intentar arrastrarse fuera del plato. En este caso, el experimentador puede extenderse la misma cantidad de ácido palmítico alrededor de las placas PTZ. Difundimos 25 L de 10 mg de ácido palmítico / ml EtOH.

Las respuestas de comportamiento de una selección de C. elegans mutantes de transmisión sináptica de aldicarb y PTZ

Nombre mutante	Función sináptica	Comportamiento sin Drogas	Respuesta de comportamiento para Aldicarb (en comparación con el tipo salvaje N2)	La respuesta conductual a PTZ
tom-1 (ok188)	inhibe la transmisión sináptica	falta de coordinación	mayor tasa de parálisis	indistinguible de la de tipo salvaje
unc-43 (n498n1186)	complejo	falta de coordinación	mayor tasa de parálisis	todo el cuerpo las convulsiones
unc-25 (e156)	facilita la transmisión de GABA	falta de coordinación	mayor tasa de parálisis	convulsiones anterior, todo el cuerpo parálisis
SNB-1 (md247)	promueve la transmisión sináptica	falta de coordinación	reducción del tipo de parálisis	convulsiones anterior
UNC-4 (e120)	promueve la transmisión de ACh	falta de coordinación	reducción del tipo de parálisis	indistinguible de la de tipo salvaje

Dos estimulantes neural, un inhibidor de la acetilcolinesterasa, llamado aldicarb, y un antagonista de los receptores GABA, llamada pentilentetrazol (PTZ), se puede utilizar de manera complementaria para caracterizar C. elegans mutantes sináptica de la transmisión. El exceso de excitación acetilcolina (ACh) se acumula en el cuerpo del gusano de la pared las uniones neuromusculares (NMJs) de mutaciones deletéreas en los reguladores negativos de la ACh transmisión (por ejemplo, tom-1 y unc-43) o reguladores positivos de la inhibitoria de transmisión de GABA (por ejemplo, unc-25). Por el contrario, los niveles de excitación ACh en NMJs gusano se ven disminuidos por las mutaciones deletéreas en los reguladores positivos de la transmisión sináptica en general (por ejemplo, SNB-1) o ACh genes específicos de la transmisión (por ejemplo, UNC-4). En comparación con los gusanos de tipo salvaje N2, gusanos mutantes con transmisión elevada excitación ACh en NMJs presentan aumento de las tasas de aldicarb parálisis inducida, mientras que los gusanos mutantes con la transmisión de baja excitación ACh demostrar los tipos reducidos del aldicarb parálisis inducida. Aunque PTZ altera la sincronía neuronal en C. elegans músculos de la pared del cuerpo, no a diferencia de aldicarb, PTZ también antagoniza inhibidor GABA en los músculos de la cabeza C. elegans. Como resultado, la sensibilidad aldicarb no pueden predecir con precisión la sensibilidad PTZ. Gusanos mutantes con defectos específicos en regul negativo o positivoción de la transmisión de acetilcolina son indistinguibles de los gusanos N2 de tipo salvaje en la presencia de PTZ, mientras que los gusanos mutantes con defectos en la regulación positiva de la transmisión sináptica en general o defectos específicos en la exposición de la transmisión inhibitoria GABA robusta PTZ convulsiones inducidas anterior. Por otra parte, unc-43 la pérdida de función de mutantes pantalla de cuerpo entero convulsiones en presencia de PTZ y probablemente tienen más anomalías en la transmisión sináptica, que contribuyen a las respuestas medicamento único.

Discusión

Los protocolos actuales para la exposición con aldicarb C. elegans no permiten distinguir entre los experimentadores de mutantes con déficits específicos en la transmisión de acetilcolina y los mutantes con un déficit generalizado en la transmisión sináptica, ya que ambas clases de mutantes presentan resistencia a aldicarb. Del mismo modo, el aldicarb no se puede utilizar para determinar si los mutantes tienen un déficit específico en la transmisión de GABA o fallas generalizadas de regular negativamente la transmisión d...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aldicarb	Reagent	Supelco, Sigma-Aldrich	PS734	Purchasable from Sigma
Pentylenetetrazole	Reagent	Sigma-Aldrich	P6500