Método para la Cultura de primeros embriones del polluelo ex vivo (Nueva Cultura)

Resumen

Este video muestra la nueva cultura, un método por el cual los embriones de pollo se cultivan fuera del huevo hasta por 24 horas. Este método le permite a uno para estudiar el desarrollo temprano (línea primitiva a 14 som.), Un período que corresponde a E7-9 en el ratón. Las aplicaciones de esta técnica incluyen la electroporación, la hibridación in situ e inmunohistoquímica.

Resumen

El embrión de pollo es una herramienta valiosa en el estudio del desarrollo embrionario temprano. Su transparencia, accesibilidad y facilidad de manipulación, lo hacen una herramienta ideal para estudiar la formación y los patrones del cerebro, del tubo neural, somite y primordios corazón. Aplicaciones de la cultura de embrión de pollo incluyen electroporación de construcciones de ADN o ARN para analizar la función del gen, los injertos de cuentas del factor de crecimiento FGF revestidos, tales como BMP y, así como montar toda la hibridación in situ e inmunohistoquímica. Este video muestra los diferentes pasos en la cultura de embrión de pollo, En primer lugar, el embrión es explantados en solución salina. Luego, el embrión se centra en un anillo de cristal. Las membranas que rodean el embrión se levantan a lo largo de las paredes del anillo. El anillo se coloca en un plato de cultivo que contiene un grupo de albúmina. La placa de cultivo se sella y se coloca en una cámara húmeda, donde el embrión se cultiva durante hasta 24 horas. Finalmente, el embrión se retira del ring, fijados y procesados ​​para otras aplicaciones. Una guía de solución de problemas también se presenta.

Protocolo

Parte 1: Banco establecido

1. Una cámara húmeda se prepara colocando Kimwipe / _ddH2O en la cámara de plástico.
2. Un tubo Falcon a recoger los platos de albúmina, la cultura, anillos, vidrio de reloj y la eliminación de desechos se colocan en el banco.
3. Plato Pyrex se llena con solución salina 1,4 l (ver notas [a]).

Parte 2: Embrión es explantados en solución salina

1. Los huevos son retirados de la incubadora después de 16 horas (fase 4). El huevo es opene tocando la concha con una pinza. Pedazos de la cáscara son removidas.
2. La delgada albúmina se recoge en un tubo Falcon. El grueso de albúmina se retira con una pinza.
3. El embrión se coloca en un plato de plástico en el interior del plato de solución salina. La albúmina restante se elimina con las pinzas.

Parte 3: Embrión se centra en el anillo

1. El saco vitelino se inclina con una pinza para que el embrión hacia arriba.
2. El saco vitelino se corta a nivel del ecuador o por debajo.
3. Con unas pinzas finas, la membrana vitelina es rápidamente pelados. La membrana vitelina está orientada de modo que su lado granular (no brillante) hacia arriba.
4. Con unas pinzas finas, la membrana vitelina se coloca en el vidrio de reloj.
5. Con unas pinzas finas, un anillo de cristal se aplica en la parte superior de la membrana vitelina y el embrión está centrado.
6. La membrana vitelina se eleva alrededor de los bordes del anillo de cristal. El montaje se retira de la fuente de solución salina.

Parte 4: La cultura se configura bajo el microscopio

1. La membrana vitelina se levanta sobre el anillo de cristal con unas pinzas finas bajo el microscopio.
2. Utilizando una pipeta Pasteur, la solución salina se elimina desde el borde exterior del anillo.
3. Usando tijeras finas, el exceso de membrana vitelina se elimina desde el borde interior del anillo de cristal. Hay que tener cuidado de no perforar la membrana con una pipeta o fórceps.
4. El embrión es suavemente enjuagarse con solución salina para eliminar las membranas de las células sueltas y yema de huevo.
5. 200 l de solución salina se añade al borde exterior del anillo (lo que facilitará su posterior transferencia).
6. El conjunto se cubre con un plato de plástico invertida.

Parte 5: La cultura se transmite a la incubadora

1. Un plato de cultivo de Falcon se etiqueta.
2. 2,5 ml de albúmina fina se añade a la parte inferior de la placa Falcon.
3. 200μl de fina albúmina se agrega a la parte interior de la tapa de la placa Falcon.
4. El plato invertido se retira de la asamblea.
5. Con unas pinzas finas, el anillo de cristal es deslizado a lo largo del borde del vidrio de reloj, y se transfiere a la placa Falcon.
6. Todas las salinas restante se elimina de la superficie interior del anillo.
7. El plato Falcon está cubierto con una tapa y sellado.
8. El conjunto se coloca en la cámara húmeda y luego en la incubadora.
9. Los embriones se cultivaron durante 24 horas a 38 ° C.

Parte 6: A raíz de la cultura, el embrión se fija, la cultura se transfiere a la incubadora

1. Un plato de fijación está lleno de helado de PBS (PBS-DEPC o si los embriones se van a procesar para la hibridación in situ).
2. La cultura se retira de la incubadora y de inmediato se coloca en hielo. La placa de cultivo se llena inmediatamente con helado de PBS / PBS-DEPC.
3. El embrión se separa de la membrana vitelina. El embrión se transfiere a la placa de fijación, con el extremo romo de una pipeta Pasteur.
4. El embrión se fija por el uso de extremos romos pinzas finas. La PBS que cubre el plato de fijación se retira. Fijador, se añade (ver notas [b]).
5. Dependiendo de la aplicación, el embrión se fija por 6-8 horas a 4 ° C (criostato), S / N a 4 ° C (en situs), o 1 hora a temperatura ambiente durante toda la inmunohistoquímica de montaje.
6. El fijador es eliminado y reemplazado con helado de PBS / PBS DEPC.
7. Para aplicaciones posteriores, tales como la hibridación in situ o tinción immantibody: el sistema nervioso y el corazón están perforadas con una aguja punta roma microcapilar o un cuchillo de microdisección, lo que evitará la captura de la sonda / anticuerpo en los pasos posteriores.
   
   Notas: [a] de solución salina se compone de: solución A (de 1 l): 121,0 g de NaCl, KCl 15,5 g, 10,4 g de CaCl ₂ .2 H ₂ O, 12,7 g de MgCl ₂ .6 H ₂ O, la solución B (para 1 l) : 2,4 g de Na ₂ HPO ₄ .2 H ₂ O, 0,2 g de NaH ₂ PO ₄ .2 H ₂ O; autoclave; Antes de su uso, mezclar 120 ml A con 2700 ml de H ₂ O, agregar 180 ml ​​B. Mix [1]; [b] fijador se prepara justo antes de su uso (4% PFA en PBS o PBS-DEPC en situs).

Parte 7: Resultados de Representante

Antes de la cultura, el embrión se encuentra en fase de línea primitiva (HH4). Al final del período de cultivo, el embrión se ha desarrollado hasta HH10 (longitud de 2-3 mm) y es visible en el centro de la placa de cultivo. Es posible que la etiqueta de un grupo de células con carbocyanine fluorescentes DIIjusto antes de la cultura (0 h) y seguir sus movimientos en todo el período de cultivo. En este caso, las células por debajo del nodo de Hensen (HN) fueron etiquetados con DII. Estas células son factores que contribuyen a desarrollar de forma progresiva somitas (SOM) y la notocorda (n).

Parte 8: Solución de problemas

Problema	Causa	Remedio
Embrión se mantiene con la yema en vez de venir de una membrana (paso 2)	La mala calidad del huevo	Solicitud de nueva producción los huevos, los huevos tienda a 13 ° C a la recepción. Incubar los huevos el mismo día de la fecha de llegada.
Vitelina diapositivas membrana lejos de la colocación de relojes de cristal de la siguiente anillo (paso 3)	Restos de albúmina	En el paso 2, asegúrese de que todos los albúmina se quita tirando de ella fuera de la membrana con una pinza inclinada
Embrión no es accesible: se encuentra debajo de la membrana (paso 4)	Lado equivocado de la membrana hacia arriba	En el paso 3, asegúrese de que el lado de la membrana que contienen gránulos de yema hacia arriba. El lado brillante, pulido debe mirar hacia abajo.
Embrión sumergido en la cultura siguientes salinos / albúmina (paso 6)	Agujero en la membrana, solución salina / albúmina izquierda dentro del anillo antes de que la cultura	En el paso 5, asegúrese de que todos los albúmina / solución salina se elimina desde el interior del anillo, en el paso 4, asegúrese de que usted no perforar la membrana con una pinza (el uso de fórceps romos)
Embrión se desintegró después de la cultura	La infección bacteriana	Esterilizar todas las herramientas y sus manufacturas, el uso de antibióticos / antimicóticos

Discusión

El método de cultivo de Nueva ² puede ser utilizado para una amplia variedad de aplicaciones, que van desde los injertos de factor de crecimiento que contiene perlas de ^tres, para montar toda la hibridación in situ y todo monte inmunohistoquímica ^4. La cultura durante un período de 24 horas permite el seguimiento continuo del desarrollo embrionario en aplicaciones tales como el análisis de lapso de tiempo el movimiento celular ⁵ o el seguimiento de las buenas prácticas agra...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Eggs	Animal	Charles River Laboratories	Premium Fertile
Stereomicroscope	Microscope	Leica Microsystems	MZ9.5 or similar
Marsh Automatic Incubator	Tool	Lyon	RX
Hybridization Incubator	Tool	Robbins Scientific, SciGene	M1000
Pyrex dish (2)	Tool
Watchmaker’s glass 50mm	Tool	VWR international	66112-060
Glass rings	Tool	Physical Plant facility		cut 4 mm thick sections of glass tubing (27 mm outer diam, 25 mm inner diam). Do not fine polish.
Curved Forceps (1)	Surgery	Electron Microscopy Sciences	72991-4C
Forceps (2)	Surgery	Fine Science Tools	11002-13	blunt ended using sharpening Stone and 100ul mineral oil
Sharpening Stone Dan’s Black Arkansas	Surgery	Electron Microscopy Sciences	62082-00
Fine scissors	Surgery	Fine Science Tools	14161-10
Plastic dishes	Tool	Falcon BD	353001
Rubber Bulb	Tool	Electron Microscopy Sciences	70980
Pasteur Capillary Pipette	Tool	Electron Microscopy Sciences	70950-12	round edge under flame
Microcapillary tube	Surgery	Sigma-Aldrich	P1049-1PAK	Pull using vertical micropipette puller; blunt end with fine forceps
Microdissecting knife	Surgery	Fine Science Tools	10056-12	Use to puncture cavities prior to in situ hybridization
Minuten pins 0.2mm diam	Surgery	Fine Science Tools	26002-20
Sylgard 184 Silicon Elastomer Curing Agent and Base	Reagent	Dow Corning	0001986475	Mix 1 part Curing Agent, 9 parts Base; set O/N at 37C
Diethylpyrocarbonate (depc)	Reagent	Acros Organics	10025025	Add 1ml depc to 1l PBS; shake; autoclave