Pulido a presión para la Mejora de pipetas de patch-clamp grabación

Resumen

Esta es una guía para modificar la forma de pipetas de vidrio. En concreto, mediante el uso de calor y presión de aire el cono se ensancha sin aumentar la apertura de la punta, lo que lleva a la resistencia a la pipeta inferior. Esto es fundamental para conseguir grabaciones de bajo nivel de ruido de células pequeñas, pero es útil en muchas aplicaciones.

Resumen

La presión de pulido es un método para dar forma a las pipetas de vidrio para la grabación de patch-clamp. En primer lugar, desarrolló este método para la fabricación de pipetas adecuado para la grabación de los pequeños (<3 m) los cuerpos de las células neuronales. El principio básico es similar al de soplado de vidrio y combina la presión del aire y el calor para modificar la forma de pipetas parche preparado por un extractor de micropipeta convencionales. Se puede aplicar a las llamadas blandas (refresco de limón) y difícil de anteojos (borosilicato). En términos generales, el pulido de presión puede reducir la resistencia a la pipeta en un 25% sin disminuir el diámetro de la abertura de la punta (Goodman y Lockery, 2000). Se puede aplicar a prácticamente cualquier tipo de vidrio y sólo requiere la adición de una válvula de alta presión y la instalación de un microforge. Esta técnica es esencial para la grabación de las células ultra (<5 m) y también puede mejorar de un solo canal de grabación, reduciendo al mínimo la resistencia a la pipeta. La forma contundente es también útil para la grabación de la abrazadera perforada del parche ya que los resultados de la punta en forma de una vesícula de membrana más grande disponible para la perforación.

Protocolo

Pipetas tirando

El uso de un filamento, como un extractor de Sutter P-97 Extractor de microelectrodos Flaming / Brown, tirar de un conjunto de aproximadamente 10-20 pipetas.

1. Seleccione su vaso. Usamos borosilicato (BF150-86-10, OD = 1,5 mm, ID = 0,86 mm). Almacenar el vidrio con cuidado para que permanezca limpia y libre de polvo.
2. Diseñar un programa de extracción. El objetivo principal es la apertura de una punta de aproximadamente el tamaño deseado, lo que dependerá de la aplicación. P-97 de Sutter Cookbook Pipetear ² es una excelente referencia.
3. Observe sus pipetas bajo un microscopio para determinar el diámetro de apertura y suavidad. Deseche las puntas ásperas, desiguales o irregulares. Para la grabación estándar de patch clamp, una abertura que es de 2-4 micras en que es mejor. A punta roma conduce a una menor resistencia para el diámetro de la apertura misma, que es el preferido. Forma y tamaño se puede modificar durante el pulido, a continuación.

Pipetas de la presión de pulido

1. Adjuntar un soporte de pipeta a una línea de limpia, el aire comprimido. El uso de un regulador, el aire comprimido a la presión de la línea ~ 40 PSI. Conecte la línea de aire comprimido a una válvula de control de 4 vías que permitan la presión de soporte de pipeta que se enciende y se apaga. Conecte un soporte de pipeta a la válvula de control con una longitud de ⅛ en tubos de Tygon ®.
2. Use un equipo de pulido (microforge) con un soporte de pipeta de alta presión, una bobina de pulido controlado por un pedal, un microscopio equipado con un aumento de baja y alta, de larga distancia de trabajo (a ser posible, 10x y 100x) el aire objetivos. Es muy importante para poder observar la apertura de una pipeta durante el protocolo.
3. Opcional: Escudo de la pipeta con un aislante hidrofóbico para disminuir la capacidad y mejorar las características de ruido (ver "pipetas tirón" de esta técnica).
4. Verifique que la válvula de presión está en la posición de apagado. Lugar de una pipeta en el soporte de la pipeta y apriete la conexión de los dedos.
   
   Nota de seguridad: Si la pipeta se mantiene firmemente en el soporte de la pipeta, la presión del aire hará que la pipeta para ser expulsado de la titular de la pipeta.
   
   
5. Coloque la probeta y el titular de la microforge. La posición del titular de la pipeta en la platina del microscopio de modo que la punta y la bobina de pulido son visibles en el bajo (10x) de potencia en el microforge. Acerque la punta del ~ 75 micrones del filamento. Tenga en cuenta que el filamento se expande cuando se calienta.
6. Cambie a la alta potencia (100 veces) objetivo. Tanto la punta de la pipeta y la bobina de pulido debe estar en el enfoque y en el campo de visión. Si no es así, ajuste la altura de la bobina de pulido. (La posición de la pipeta no se puede ajustar). La punta de la pipeta y la bobina de pulido debe estar cerca de los lados opuestos del campo de visión. Evite colocar la bobina demasiado cerca de la punta de la pipeta, ya que se ampliará a medida que se calienta y chocar con la pipeta.
7. Gire la válvula para dirigir el aire a presión dentro de la pipeta, y el calor de la punta de la pipeta hasta que el cono detrás de la punta empieza a balón hacia el exterior.
8. Detener el calentamiento antes de la punta de globos demasiado extensa. La experimentación es necesaria para determinar la distancia apropiada, el calor y el tiempo de la forma deseada.
9. Opcional: Reducir el diámetro de apertura de la punta de pulir la punta en la ausencia de presión. Los pasos 7 y 8 se puede repetir para afinar la forma y dimensiones de la punta de la pipeta.
10. Apague la presión y el tiempo que señala la punta de la pipeta en una dirección segura, retirar la pipeta y colocarla en una caja limpia, donde serán protegidos contra el polvo.
    
    Nota de seguridad: Si la presión del aire no se apaga, la pipeta puede ser expulsado del titular de la pipeta durante la extracción.

Notas sobre la microforge

Utilizamos un microforge ensambladas a partir de off-the-shelf partes disponibles en el mercado. (También puede comprar un kit de pulido de la presión de unas pocas compañías, por ejemplo, ALA Ciencia, GlassWorx). Independientemente de la microforge, es fundamental contar con la óptica de que son lo suficientemente buenos para ver la apertura de la punta, que a menudo es sólo una pocas micras de diámetro. Utilizamos un lente de larga distancia de trabajo 100 veces para este propósito. Además, la capa de la bobina de pulido de vidrio de alta temperatura de fusión con el fin de minimizar el depósito de metal vaporizado en las pipetas.

Parte 3: Resultados esperados

Pulir una presión moderada puede reducir la resistencia de una pipeta sin un cambio apreciable en la apertura de diámetro. Si lo desea, este protocolo puede ser utilizado para hacer las pipetas con sub-micron aberturas y resistencias entre 5-10MΩ.

Discusión

Lo que originalmente se desarrolló este método para pipetas útil para la grabación de patch-clamp 2-3 micras neuronas en C. elegans ^1. Es en el uso rutinario en el laboratorio de Goodman. Estamos a la presión de uñas pipetas no sólo para la grabación de pequeñas C. neuronas elegans, pero también para la obtención de grabaciones macropatch y de un solo canal de los canales iónicos expresados ​​en ovocitos de Xenopus. Para que una punta de apertura de diámetro, la forma contundente produc...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glass Capillaries	Consumable	Sutter Instrument Co.	BF150-85-10 (or similar)	The method works with any type of capillary except those made from quartz. However, we recommend using capillaries with a filament.
Inverted Microscope	Microscope	Leica Microsystems	DM IL (or similar)	Any simple inverted microscope will do. However, it is essential to have sufficient magnification to see pipettes during polishing. We use a 100x metallurgical lens with a long working distance for this purpose.
Microforge Kit	Tool	ALA Science	CPM-2	Supplies polishing coil, controller and foot pedal.
Air pressure source	Tool	ALA Science	PR-60	Accessory for providing high pressure, includes a suitable valve. Alternatively, compressed air from the building can be used together with a filter/regulator (set to 40 PSI) and a 4-way valve (see below)
4-way valve	Tool	Cole-Parmer	A-98150-01	Fittings will be needed to couple valve to tubing
Pipette Holder with Luer Connector	Tool	World Precision Instruments, Inc.	MPH-6S20	Use a male luer-to-barb fitting to connect pipette holder to high-pressure tubing
Tygon® tubing	Tool	Cole-Parmer	06408-62	Use this tubing to connect pipette holder to 4-way valve