1. Preparación

1. Antes de comenzar, ponte guantes de laboratorio y la ropa protectora adecuada.
2. Esterilice todas las herramientas de disección, primero con un detergente y luego con 70% de etanol y luego seque bien.
3. Preparar 50 ml de la solución salina equilibrada de Hank (HBSS) que contiene un 2% de suero de becerro fetal (FCS).

2. Disección

1. Usando un sistema de administración de dióxido de carbono, eutanasia el ratón por hipoxia. Asegure el ratón eutanasiado en una placa de disección en posición supina y realice una laparotomía longitudinal utilizando tijeras y fórceps.
2. Usando fórceps, mueva los intestinos y el estómago en el lado derecho del abdomen para exponer el estómago y el bazo. El bazo está unido al estómago.
3. Usando fórceps separa cuidadosamente el bazo del estómago y colócalo en la placa Petri que contiene 5 ml de HBSS 2% FCS.

3. Aislamiento celular inmune

1. Coloque el bazo sobre un colador de células de 40 m sobre la misma placa De Petri. Aplastar el bazo con un émbolo para disociarlo.
2. Transfiera el bazo disociado y el líquido a un tubo centrífugo de 15 ml.
3. Centrifugar el tubo a 370 x g durante 7 min a 10oC y desechar el sobrenadante evitando el pellet.
4. Resuspenda el pellet en 2 ml de acetato de potasio para lisar los eritrocitos. Espere 2 minutos y luego suba el volumen hasta 15 ml usando HBSS 2% FCS.
5. Centrifugar el tubo de nuevo a 370 x g durante 7 min a 10oC. Deseche el sobrenadante y resuspenda el pellet en 5 ml de HBSS 2% FCS.
6. Cuente las células usando un ensayo de tinción azul trypan y ajuste la concentración celular final a 10⁷ celdas/ml usando un volumen apropiado de HBSS 2% FCS.

4. Tinción CFSE y Estimulación de células T

1. Distribuir 10⁷ células/tubo aislados en 4 tubos (tubos de 15 ml, etiquetados 1 a 4)
2. Añadir 3 ml de HBSS 2%FCS a cada tubo.
3. Añadir 1 l de CSFE en cada tubo (concentración final de 5 m).
4. Incubar los tubos a 37oC en una incubadora de_CO2 al 5% durante 10 min.
5. En los tubos 3 y 4, añadir 12 ml de anticuerpo HBSS 2% FCS + anti-CD3 a una concentración final de 2,5 g/ml. Los tubos 3 y 4 se estimulan utilizando anticuerpos anti-CD3, para observar el efecto en el ciclo celular.
6. En los tubos 1 y 2 añadir 12 mL de HBSS 2% FCS. Las células de los tubos 1 y 2 no serán estimuladas.
7. Centrifugar todos los tubos a 370 x g durante 7 min a 10oC. Descarta los supernatantes.
8. Resuspenda los pellets en 2 ml de HBSS 2%FCS.
9. Transfiera las soluciones resultantes a pozos separados en una placa de 6 pocillos.
10. Incubar las células a 37oC, 5%_CO2 durante 3 días.

5. Tinción celular

1. En el día 3, añadir 2 mL HBSS 2%FCS en los pozos 1 y 3.
2. Pipeta vigorosamente y transfiera las muestras a tubos FACS de 5 ml.
3. Continúe incubando las células restantes de los pozos 2-4 a 37oC, 5% CO_2. Se analizarán el día 5 para investigar los efectos a largo plazo de la estimulación en el ciclo celular.
4. Centrifugar los tubos a 370 x g durante 7 min a 10oC. Descarta los supernatantes.
5. Añadir 100 l de mezcla de anticuerpos (ver Tabla 1) a cada tubo.

Tabla 1: Composición de mezcla de anticuerpos. Cuatro preparaciones de cócteles de anticuerpos utilizando conjugados concentrados de anticuerpos fluorescentes y HBSS.

6. Incubar los tubos durante 20 minutos sobre hielo en la oscuridad.
7. Añadir 1 ml de HBSS 2%FCS y centrifugar los tubos a 370 x g durante 7 min a 10oC.
8. Deseche el sobrenadante y resuspenda los gránulos en 200 l de HBSS 2% FCS.
9. Transfiera los pellets resuspendidos a nuevos tubos FACS etiquetados.
10. Evalúe la proliferación de células T mediante FACS.
11. En el día 5, repita el proceso de tinción celular con las células de los dos pozos restantes de la placa de 6 pocillos.

6. Análisis de datos

1. Abra el software "FlowJo" y arrastre los archivos a la ventana"Todos losejemplos".
2. Haga doble clic en el archivo para las celdas no estimuladas recopiladas en el día 3 para mostrar una gráfica de puntos con dispersión hacia delante en el eje Y y dispersión lateral en el eje X.
3. Haga clic en"Polígono"y cree una estrategia de gating para seleccionar células linfoides, Thy1.2⁺ CD3⁺ células y distinguir CD4⁺ y CD8⁺ células (ver Figura 1).

Figura 1: Estrategia de gaseo. Las células se encerradan primero en función de su morfología (izquierda: FSC-A, SSC-A). Las células T se agaran (medio: CD3, Thy1.2) y se dividen en células CD4⁺ T (naranja) y células CD8⁺ T (azul) (derecha: CD4, CD8). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

4. Repita los pasos con otros archivos.
5. Para determinar las frecuencias de las celdas divisorias y no divisorias, primero visualice las poblaciones de celdas haciendo clic en"Editorde diseño ."
6. Arrastre las celdas T CD4 y CD8 T de cada uno de los cuatro tubos a la"Ventana de muestra Todo"
7. Aparecerán gráficos que representan a cada población.
8. Utilice histograma para visualizar los resultados y seleccione"CFSE"como parámetro para la comparación de los diferentes tubos y las diferentes poblaciones.
9. Las células no divisorias mantienen niveles más altos de CFSE, mientras que las células que proliferan dividen el contenido de CFSE en células divisorias
10. Cree una puerta en celdas que no sean divisorias y aplíquela en todos los tubos.
11. Crea una puerta en las celdas divisorias y aplítala en todos los tubos.
12. Para examinar la frecuencia de división de celdas CD3+, haga clic en "Editor detablas ."
13. Arrastre las poblaciones de interés - dividiendo las células T CD8 y dividiendo las células T CD4 - en"Tabla."
14. En el menú"Estadística",seleccione "frecuencia de las celdas T,luego haga clic en"Crear tabla"para revelar la frecuencia en una nueva tabla.
15. Haga clic en"Crear tabla." Para revelar los valores de frecuencia, aparezca en una nueva tabla.