Este material está basado en la investigación apoyada (o apoyado en parte por) la Oficina de Tecnología de Comercialización, Salt Lake City, UT, Oficina de Investigación y Desarrollo, Rehabilitación de investigación y de servicio D, DVA SLC Sistema de Cuidado de la Salud, Salt Lake City, UT, del Departamento de Defensa PRMRP Grant (N º PR054520), el Presidente Albert Hofmann y Margaret y el Departamento de Ortopedia de la Universidad de Utah, Facultad de Medicina de Salt Lake City, UT, apoyo técnico para las simulaciones fue proporcionada por el Centro de Informática Biomédica Integral de Computación Científica e Imagen del Instituto y se hizo posible en parte por el software del Centro de NIH / CNRR de Informática Biomédica Integral, P41-RR12553-07. Reconocimiento adicional se extiende a Gwenevere Shaw para obtener ayuda con la preparación de manuscritos y Dustin Williams para la imagen de la biopelícula.

Parte 1: El uso de la tomografía computarizada (TC) para Amputado Reconstrucción <ol><li> Retrospectiva de la TC se obtuvieron de la Universidad de Utah y el Departamento de Asuntos de Veteranos de los hospitales después de obtener la aprobación del IRB y la HIPAA. </li><li> Las tomografías computarizadas fueron seleccionados debido a que permiten una clara distinción entre los tipos de tejidos basados ​​en rayos X absorción. </li><li> TC fueron inspeccionados de forma manual y se incluyen en el estudio basado en la ausencia de los implantes de metal para evitar que los artefactos de la imagen. </li></ol> Parte 2: Generación de modelos con Seg3D <ol><li> Los archivos fueron descargados en las imágenes Dicom y se cargan en Seg3D (versión 1.11.0, software.sci.utah.edu) como un nuevo volumen. </li><li> Un filtro de mediana se utiliza para suavizar los volúmenes de importación antes de determinar geométricamente definidas las estructuras de tejido. </li><li> Los límites del tejido del hueso, la médula ósea, órganos y tejido adiposo fueron generados por el umbral de forma interactiva los archivos CT (Figura 1). <img src="/files/ftp_upload/1237/1237fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1: Una sección sagital de un miembro amputado un umbral residual y se dividieron en tipos específicos de tejido. </li><li> La musculatura se obtuvo mediante la configuración manual de los puntos de la semilla en el interior del tejido muscular y un umbral con una confianza conectados filtro para encontrar todos los tejidos conectados a los puntos de la semilla. Este paso elimina los tejidos erróneos que pueden haber sido agrupados con el músculo sobre la base de absorción similares de TI. </li><li> La piel, lo cual era imposible de discernir de forma fiable a partir de las imágenes de TC, fue generado por la dilatación de los tejidos exteriores de 2 milímetros de grosor de la piel basado en promedio para producir una capa de espesor homogéneo que rodeaba todo el modelo 1. </li><li> Segmentaciones fueron inspeccionados de forma manual, corregido para asegurar la exactitud y se combinan en una jerarquía en un mapa sola etiqueta requerida para el análisis de elementos finitos (figura 1). <img src="/files/ftp_upload/1237/1237fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2: Modelo Representante jerárquica de un amputado bilateral creado con Seg3D. </li></ol> Parte 3: Preparación para el análisis de elementos finitos <ol><li> Un implante de 10 cm fue diseñado en Matlab para servir como dispositivo ortopédico implanta y el cátodo de estimulación eléctrica e importados en SCIRun (versión 4.0, software.sci.utah.edu). </li></ol> Parte 4: colocación de los electrodos y Diseño <ol><li> SCIRun se utilizó para el diseño de los electrodos, ya que admite la colocación de electrodos interactivas y de simulación. </li><li> Se creó una red y los módulos organizados con funciones específicas para generar la malla (Figura 3). Los módulos fueron importantes para definir las condiciones de contorno, la conductividad del tejido, el refinamiento de malla, la generación de Matlab histogramas, grabación de datos de campo, etc (Tabla 1). <img src="/files/ftp_upload/1237/1237fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3: imagen de red Representante de un estudio piloto utilizando una configuración de dos bandas de electrodos externos. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Tabla 1 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Conductividades asignados a los tejidos segmentado </td></tr><tr><td> Tipo de tejido </td><td> Conductividades [S / m] </td></tr><tr><td> Órgano </td><td> 0.22 </td></tr><tr><td> Piel </td><td> 0.26 </td></tr><tr><td> Adiposo </td><td> 0.09 </td></tr><tr><td> Músculo </td><td> 0.25 </td></tr><tr><td> El hueso cortical </td><td> 0.02 </td></tr><tr><td> De médula ósea </td><td> 0.07 </td></tr></tbody></table></li><li> Las configuraciones de los electrodos consiste en un electrodo de un parche, dos electrodos de parche, una banda continua y dos bandas continuas. </li><li> Bandas externas de electrodos se aplicaron en el muñón de los modelos generados a partir de los pacientes la TC y fueron de 1,6 cm de espesor. </li><li> Parches de los electrodos fueron colocados en una franja que cubre aproximadamente la mitad del diámetro de la extremidad residual y fueron de 3 cm de espesor. </li><li> El implante cortical interna que representa el implante osteointegrado fue establecido en diámetro endoóseo para permitir el ajuste perfecto del implante y llenar 2. </li></ol> Parte 5: Análisis de elementos finitos <ol><li> Las simulaciones se han generado el supuesto de que las mediciones eléctricas se podría calcular con un enfoque cuasi-estático, sin dependencia del tiempo. </li><li> El modelo se calculó mediante la resolución de la ecuación de Laplace para cada tipo de tejido generados a partir de las segmentaciones Seg3D. </li><li> Las condiciones de frontera fueron formados por los electrodos que inyecta corrientes y las directrices que la corriente se mantuvo dentro del cuerpo. </li><li> Dado que los electrodos y el implante se una conductividad mucho mayor que los tejidos circundantes, se trataba de unassumed que el implante (cátodo) se encontraba en un potencial constante, del mismo modo que los electrodos de superficie se modela con una diferencia de potencial del implante percutáneo. </li><li> Para evaluar la eficacia de la configuración de los electrodos y el tamaño, el paciente se han desarrollado modelos específicos y el potencial eléctrico en torno a la interfase del implante se utilizó para determinar los puntos fuertes localizados sobre el terreno. </li><li> El modelo se ha generado mediante una malla de hexaedros que consistía en aproximadamente 1,8 millones de elementos que fueron tratados como trozos homogéneos, óhmica e isótropo. </li><li> El modelo óptimo para este experimento fue seleccionado con una diferencia relativa &lt;5% en los gradientes de tensión confirmado con un estudio de sensibilidad de malla para asegurar la exactitud del modelo (Tabla 2). <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0" width="305"><tbody><tr><td> Tabla 2 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="3"> Malla de estudio de sensibilidad para Amputado Modelo </td><td></td></tr><tr><td> Malla </td><td> Elementos </td><td> Nodos </td><td> Diferencia relativa </td></tr><tr><td> 100 100 50 </td><td> 149089 </td><td> 161131 </td><td> 0,0995 </td></tr><tr><td> 125 125 75 </td><td> 350180 </td><td> 371472 </td><td> 0,0802 </td></tr><tr><td> 150 150 100 </td><td> 673032 </td><td> 706082 </td><td> 0,0545 </td></tr><tr><td> 175 175 125 </td><td> 1146778 </td><td> 1194044 </td><td> 0,0527 </td></tr><tr><td> 200 200 150 </td><td> 1796690 </td><td> 1860772 </td><td> 0,0439 </td></tr><tr><td> 250 250 200 </td><td> 3745038 </td><td> 3850202 </td><td> 0,0364 </td></tr><tr><td> 275 275 225 </td><td> 5097243 </td><td> 5226587 </td><td> 0,0301 </td></tr><tr><td> 300 300 250 </td><td> 6742588 </td><td> 6898729 </td><td> 0,0000 </td></tr></tbody></table></li><li> Utilizando un proceso iterativo solver, los indicadores eléctricos en los modelos de elementos finitos se calcularon para las configuraciones de electrodos. </li></ol>

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La tecnología divulgada en el artículo, específicamente la utilización de un implante ortopédico como cátodo funcional para aumentar la vinculación del esqueleto, reducir la rehabilitación y prevenir la adhesión bacteriana es una idea nueva inventada por el primer autor en la presentación de la revista. Una forma de divulgación de la invención ha sido presentada a la Universidad de Utah y una patente provisional de Estados Unidos se ha presentado la protección de toda la tecnología de revelado.

La comprensión del paradigma Estimulación Eléctrica Mejoras en la atención médica y las estrategias de evacuación en el campo de combate han conducido a un mayor número de guerreros supervivientes lesiones catastróficas relacionadas con la guerra. Mientras que la tasa de supervivencia es un avance médico, hombres y mujeres regresan de combate con amputaciones que necesitan un seguimiento intensivo de atención, rehabilitación extensa y costosa servicios de prótesis del Sistema de Atención de Asuntos de Veteranos de la Salud 3. Informes detallados del Congreso que más de 1.000 amputaciones relacionadas con la guerra se han producido como resultado de la Operación Libertad Duradera (OEF) y la Operación Libertad Iraquí (OIF), los conflictos 4. En el caso de la Operación Libertad Duradera y los veteranos de la OIF, aproximadamente el 15% de los guerreros que regresan han perdido sus extremidades múltiples y un número significativo de hombres y mujeres que regresan tienen un corto muñón donde la tecnología de socket no es una opción, o ha sido rechazada por el paciente. La utilización del producto descontinuado de la extremidad superior de la prótesis, incluso supera el 50% debido a los dispositivos de fijación son engorrosos y difíciles de usar cómodamente a 5. Prótesis de la extremidad inferior son igualmente problemáticas y los problemas comunes asociados con tomas de tejidos blandos incluyen la incapacidad para caminar sobre el reto terrain6, la duración limitada muñón 7, el malestar del paciente 5, la preocupación por no fisiológica de carga 8, irritación de la osificación heterotópica 9 y el riesgo de enfermedades debilitantes 10. Sin embargo, la tecnología de la osteointegración es una nueva técnica quirúrgica que puede reducir el dolor 11, irritación de la piel 12, 13 osseoperception mejorar, mejorar la movilidad 6, disminución de las úlceras por presión asociados con tomas de corriente 6, reducir el consumo energético para la deambulación 7,14 y servir mejor a los guerreros veteranos y con limitada longitud de la extremidad residual 15. A pesar de las numerosas ventajas físicas y psicológicas de la osteointegración, los procedimientos quirúrgicos asociados requieren más avanzado de infección por streategies tratamiento de prevención 16, exigen que los programas de rehabilitación de largo y son restrictivas protocolos que soportan el peso que puede durar hasta 1,5 años post-operatorio 17. Debido a que la viabilidad del hueso del huésped y la longitud de la extremidad residual es importante para la inserción muscular y la funcionalidad, el desarrollo de nuevos dispositivos para mejorar la osteointegración es la clave para el retorno de hombres y mujeres. Por lo tanto, el desarrollo de un diseño inteligente implante osteointegrado (OIID), sistema que utiliza la estimulación eléctrica controlada puede reducir la duración de la rehabilitación y aumentar la vinculación del esqueleto para el veterano guerrero y amputados. Sin embargo, dado que no hay ningún dispositivo disponible en el mercado actual y dirigido para el uso con implantes osteointegrados percutánea, la motivación de este programa es para confirmar la seguridad y la eficacia con análisis de elementos finitos. La comprensión del papel de la estimulación eléctrica en la remodelación ósea, en concreto la deposición de osteoids y la mineralización, se ha mantenido especulativo. Sin embargo, la actividad eléctrica observada en el hueso puede ser el resultado de la carga mecánica 18,19 y por lo tanto un estímulo eléctrico puede ser un mecanismo eficaz para inducir la reparación ósea 19. La lógica detrás de la hipótesis se explica en un modelo de curación de la fractura. Cuando los huesos largos se cargan, al lado de la tensión llega a ser electropositivo y electronegativo el lado de compresión 20,21, sin embargo, una vez que se rompe un hueso, el sitio seguirá siendo electronegativo con respecto al medio ambiente circundante hasta que la curación ha comenzado, y reanudó la homeostasis 21. Simulación de la cascada de curación natural con una señal eléctrica que se ha creído para ayudar a la deposición de calcio 22, ligeras alteraciones en el contenido de oxígeno y pH 23, el reclutamiento de factores de crecimiento y 22 asistencias con la migración de osteoblastos y la secreción de la matriz extracelular 24 adicionales. La premisa de que la estimulación eléctrica por sí solo podría gobernar completa reparación ósea se ha redefinido y la nueva hipótesis actual propone que los sindicatos se completa formada por cargas mecánicas y una estimulación eléctrica de co-estímulo 19. Los impulsos eléctricos observados en vivo están asociados con la deformación piezoeléctrica de colágeno o el gran electro-cinética producida por las corrientes iónicas que fluyen partes constituyentes últimos mineral de la matriz ósea 25. De hecho, los potenciales espontáneos se han reportado en el hueso del tamaño de 6 milivoltios y se correlaciona con un aumento en la tasa de aposición mineral del hueso 26. Los primeros trabajos de Brighton y Friedenberg 18,21,27,28 utilizado el concepto de estimulación eléctrica para la regeneración ósea en los años 1960 y 1970, y demonstrated corriente que podría ser utilizado para reparar los sindicatos no en un corto periodo de tiempo en comparación con los métodos tradicionales de curación. Modelos adicionales han investigado la formación de hueso con la carga de peso restrictiva y ha demostrado un aumento de treinta y uno por ciento en la actividad osteogénica entre los controles y de los miembros estimulados eléctricamente 25. Mientras que los investigadores en el campo de la estimulación eléctrica han allanado el camino para la comprensión del mecanismo de deposición osteoblástica de la matriz con la estimulación eléctrica, falta de comprensión ha limitado la expansión de esta tecnología. Si bien hay muchos casos de curación con éxito de la no-sindicatos y los modelos de fractura de la curación, los ejemplos de las molestias del paciente y los intentos fallidos están repletos en la literatura y 29. El problema se produce con la estimulación eléctrica de los científicos y los médicos el control de los indicadores eléctricos mal y concentrarse únicamente en las magnitudes actuales. Investigaciones previas han examinado a la actual como la &quot;bala mágica&quot; para la fijación de los aproximadamente 500.000 no los sindicatos, que se producen anualmente 30. Sin embargo, la repetibilidad entre los modelos se ha visto limitado debido a complicaciones calefacción del julio 31 y no la determinación de densidades de corriente 32. De hecho, todos los dispositivos biomédicos fabricados debe limitarse a una densidad de corriente de menos de 2 mA / cm 2 como se indica por la Comisión Electrotécnica Internacional para prevenir la necrosis de los tejidos localizados y molestias para el paciente 33. Aparte de ayudar en la fijación esquelética, la estimulación eléctrica controlada también puede impedir la adherencia de bacterias en implantes ortopédicos y reducir el riesgo de padecer esta enfermedad y la formación de biofilm 34-37. Formación de biopelículas en los dispositivos ortopédicos dar lugar a complicaciones del paciente y una angustia significativa para aquellos que dependen de estos 38 dispositivos. Se hace hincapié en la necesidad de tener completamente esterilizado instrumentos e implantes antes de la cirugía de 39 años, sin embargo, es a menudo difícil de diagnosticar adhesión bacterias como se desprende de muchos de los casos negativos cultivo que de hecho están infectadas 40. Este problema es a menudo junto con el hecho de que las biopelículas son de crecimiento lento en la naturaleza de 40 años, no puede haber crecimiento con precisión in vitro de 39 años, dependerá del tipo de las células de las bacterias, limpieza de la superficie y el sistema inmunológico de la persona afectada 39. Investigación de Europa amputados transfemoral con la tecnología oseeointegration revelan el problema más frecuente es la infección (frecuentes infecciones superficiales, 1 / 3 infecciones periprotésicas) 41. Aunque ha habido grandes mejoras en la preparación quirúrgica, la erradicación de la bacteria es uno de los factores fundamentales para mejorar la osteointegración ya que las biopelículas son entre 500-5000 mil veces más difícil de erradicar debido a su falta de forma platónica 34,35,39. Por lo tanto, la utilización de la estimulación eléctrica como una modalidad para la eliminación de colonias de bacterias dañinas y el aumento de la fijación esquelética son factores importantes para garantizar la protección de la salud del paciente y la eficacia OIID. Las ventajas de usar amputados y veterano guerrero es que la relativa juventud y la salud de otra manera bueno de estas personas hacen una población ideal para una rehabilitación agresiva y un puesto percutánea servirá de ayuda ambulatoria y puede ser desarrollado como un cátodo expuestos para la estimulación eléctrica. La presencia de un implante osteointegrado no requiere de procedimientos quirúrgicos adicionales para insertar los componentes eléctricos, permite que el dispositivo se controla externamente y evita el riesgo de la infección 42. Por lo tanto, comprender el método de inyección de corriente en el muñón de los amputados y veterano guerrero, un campo eléctrico de la magnitud de 10 a 10 V / cm se puede establecer, controlar y medir en la superficie del implante. Se presume que esto permitirá que los niveles de seguridad de la electricidad que se entregarán, capaces de inducir la migración de osteoblastos y la mejora de fijación esquelética. Un campo eléctrico de esta titulación se incrementará la cantidad y calidad del hueso en la superficie del implante, y mejorar las perspectivas de rehabilitación acelerada y la fijación esquelética de un amputado. El uso de la estimulación eléctrica no ha sido investigada como una modalidad para acelerar la osteointegración de un implante intramedular de prótesis y presenta numerosas oportunidades para la investigación traslacional para mejorar la atención al paciente. Resultados experimentales La necesidad de modelos específicos de pacientes con un dispositivo de estimulación eléctrica percutánea fue apoyada en el estudio. Las simulaciones desarrolladas para el dispositivo biomédico propuesta puede tener la capacidad de acelerar la fijación esquelética de migración de osteoblastos y aumentar la prevención de la adhesión bacteriana 27,34,36,39. Compmodelado utation efectivamente ha demostrado que 1-10 V / cm campos eléctricos y densidades de corriente por debajo de 2 mA / cm 2 puede ser generado mediante el implante de un cátodo funcional y es más homogéneamente distribuida utilizando un electrodo de dos bandas exteriores. El sistema OIID puede ser el primer paso para resolver el problema clásico asociado con la estimulación eléctrica, la incapacidad de definir las vías de corriente en el cuerpo humano 43. Por lo tanto, el establecimiento de herramientas para mejorar la fijación esquelética puede ayudar a reducir la duración de la rehabilitación requiere de un procedimiento de osteointegrados. La utilización de la estimulación eléctrica de la tercera edad amputados también es un aspecto crítico que debe ser explorado también. La masa ósea es máxima después de una década el crecimiento del esqueleto, pero deja disminuye de manera significativa por la octava y novena década 44. Como los huesos largos cambian con la edad, el diámetro endoóseo tiende a aumentar más rápidamente que el diámetro del periostio que puede llevar a aflojamiento del implante 45. Este problema, junto con la reducción de la tensión en los huesos por el debilitamiento de los músculos puede contribuir a enfermedades debilitantes como la osteoporosis y la osteopenia, 45 y necesita otras opciones de tratamiento para pacientes con implantes oseointegrados. Sin embargo, la estimulación controlada eléctrica y carga mecánica puede actuar como un catalizador de sinergias ongrowth ósea y mantener la integridad del host hueso cama con pacientes de edad avanzada con un sistema de OIID.

bioelectric analyses of an osseointegrated intelligent implant design system for amputees

El número proyectado de los amputados de América se espera que aumente a 3,6 millones en 2050. Muchas de estas personas dependen de miembros artificiales para llevar a cabo las actividades de rutina, pero las suspensiones de prótesis con tecnología de socket tradicionales puede resultar engorroso e incómodo para una persona con pérdida de extremidades. Por otra parte, para las personas con amputaciones de alta proximal, longitud limitada extremidad residual puede impedir la adhesión exoprosthesis todos juntos. Tecnología osteointegrados implante es un procedimiento quirúrgico novedoso que permite la adhesión firme del esqueleto entre el hueso receptor y un implante. Los resultados preliminares de amputados Europea con implantes oseointegrados han mostrado mejores resultados clínicos, permitiendo la transferencia directa de cargas en la interfaz hueso-implante. A pesar de las aparentes ventajas de la osteointegración en la tecnología de socket, los procedimientos de rehabilitación actuales requieren largos períodos de restricción de carga antes de que se puede reducir con apego acelerado del esqueleto a través de la estimulación eléctrica. El objetivo de (OIID) el diseño de implantes osteointegrados sistema inteligente es hacer la parte del implante de un sistema eléctrico para acelerar la unión del esqueleto y prevenir la infección periprotésica. Para determinar el tamaño y la ubicación óptima de los electrodos, se inició una prueba de concepto con el modelado computacional de los campos eléctricos y densidades de corriente que se presenten durante la estimulación eléctrica de las extremidades amputado residual. A fin de proporcionar garantizar la seguridad del paciente, los sujetos con retrospectiva la tomografía computarizada se han seleccionado y tres reconstrucciones tridimensionales creadas con programas de software a medida para asegurar la precisión anatómica (Seg3D y SCIRun) en el IRB y HIPAA aprobó el estudio. Estos paquetes de software de apoyo al desarrollo de modelos específicos del paciente y permite la manipulación interactiva de la posición de los electrodos y el tamaño. Los resultados preliminares indican que los campos eléctricos y densidades de corriente se puede generar en la interfaz implante para lograr la distribución homogénea del campo eléctrico necesario para inducir la migración de osteoblastos, mejorar la fijación esquelética y puede ayudar a prevenir las infecciones periprotésicas. Basado en las configuraciones de electrodos experimentado en el modelo, una configuración de dos bandas exteriores se defendió en el futuro.

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Bioelectric Analyses of an Osseointegrated Intelligent Implant Design System for Amputees

Hay una necesidad de desarrollar otras alternativas de conexión prótesis debido a la pérdida de una extremidad atribuidas a enfermedades vasculares oclusivas y trauma. El objetivo del trabajo es la introducción de un sistema inteligente osteointegrados diseño de los implantes para aumentar la fijación esquelética y reducir las tasas de infección periprotésica para pacientes que necesitan la tecnología osteointegrados.

Los análisis bioeléctricos de una osteointegrados Sistema Inteligente diseño de los implantes para Amputados

The projected number of American amputees is expected to rise to 3.6 million by 2050.  Many of these individuals depend on artificial limbs to perform ...

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Research

JoVE Journal

Biology

13.8K vistas.  Department of Veteran Affairs. Hay una necesidad de desarrollar otras alternativas de conexión prótesis debido a la pérdida de una extremidad atribuidas a enfermedades vasculares oclusivas y trauma. El objetivo del trabajo es la introducción de un sistema inteligente osteointegrados diseño de los implantes para aumentar la fijación esquelética y reducir las tasas de infección periprotésica para pacientes que necesitan la tecnología osteointegrados.

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Evisceration of Mouse Vitreous and Retina for Proteomic Analyses

While the mouse retina has emerged as an important genetic model for inherited retinal disease, the mouse vitreous remains to be explored. The vitreous is a highly aqueous extracellular matrix overlying the retina where intraocular as well as extraocular proteins accumulate during disease.1-3 Abnormal interactions between vitreous and retina underlie several diseases such as retinal detachment, proliferative diabetic retinopathy, uveitis, and proliferative vitreoretinopathy.1,4 The relative mouse vitreous volume is significantly smaller than the human vitreous (Figure 1), since the mouse lens occupies nearly 75% of its eye.5 This has made biochemical studies of mouse vitreous challenging. In this video article, we present a technique to dissect and isolate the mouse vitreous from the retina, which will allow use of transgenic mouse models to more clearly define the role of this extracellular matrix in the development of vitreoretinal diseases.

The dissection technique illustrates evisceration of the vitreous, retina, and lens from the mouse eye, separation by centrifugation, and characterization with protein assays.

Evisceración de vítreo y retina del ratón para análisis proteómico

While the mouse retina has emerged as an important genetic model for inherited retinal disease, the mouse vitreous remains to be explored. The vitreous is ...

Investigación

Biología

Trajectory Data Analyses for Pedestrian Space-time Activity Study

It is well recognized that human movement in the spatial and temporal dimensions has direct influence on disease transmission1-3. An infectious disease typically spreads via contact between infected and susceptible individuals in their overlapped activity spaces. Therefore, daily mobility-activity information can be used as an indicator to measure exposures to risk factors of infection. However, a major difficulty and thus the reason for paucity of studies of infectious disease transmission at the micro scale arise from the lack of detailed individual mobility data. Previously in transportation and tourism research detailed space-time activity data often relied on the time-space diary technique, which requires subjects to actively record their activities in time and space. This is highly demanding for the participants and collaboration from the participants greatly affects the quality of data4.
Modern technologies such as GPS and mobile communications have made possible the automatic collection of trajectory data. The data collected, however, is not ideal for modeling human space-time activities, limited by the accuracies of existing devices. There is also no readily available tool for efficient processing of the data for human behavior study. We present here a suite of methods and an integrated ArcGIS desktop-based visual interface for the pre-processing and spatiotemporal analyses of trajectory data. We provide examples of how such processing may be used to model human space-time activities, especially with error-rich pedestrian trajectory data, that could be useful in public health studies such as infectious disease transmission modeling.
The procedure presented includes pre-processing, trajectory segmentation, activity space characterization, density estimation and visualization, and a few other exploratory analysis methods. Pre-processing is the cleaning of noisy raw trajectory data. We introduce an interactive visual pre-processing interface as well as an automatic module. Trajectory segmentation5 involves the identification of indoor and outdoor parts from pre-processed space-time tracks. Again, both interactive visual segmentation and automatic segmentation are supported. Segmented space-time tracks are then analyzed to derive characteristics of one's activity space such as activity radius etc. Density estimation and visualization are used to examine large amount of trajectory data to model hot spots and interactions. We demonstrate both density surface mapping6 and density volume rendering7. We also include a couple of other exploratory data analyses (EDA) and visualizations tools, such as Google Earth animation support and connection analysis. The suite of analytical as well as visual methods presented in this paper may be applied to any trajectory data for space-time activity studies.

A suite of spatiotemporal processing methods are presented to analyze human trajectory data, such as that collected using a GPS device, for the purpose of modeling pedestrian space-time activities.

Los análisis de trayectoria de datos para el estudio de peatones Actividad espacio-tiempo

It is well recognized that human movement in the  spatial and temporal dimensions has direct influence on disease transmission1-3.  An infectious disease ...

Nanogold Labeling of the Yeast Endosomal System for Ultrastructural Analyses

Endosomes are one of the major membrane sorting checkpoints in eukaryotic cells and they regulate recycling or destruction of proteins mostly from the plasma membrane and the Golgi. As a result the endosomal system plays a central role in maintaining cell homeostasis, and mutations in genes belonging to this network of organelles interconnected by vesicular transport, cause severe pathologies including cancer and neurobiological disorders. It is therefore of prime relevance to understand the mechanisms underlying the biogenesis and organization of the endosomal system. The yeast Saccharomyces cerevisiae has been pivotal in this task. To specifically label and analyze at the ultrastructural level the endosomal system of this model organism, we present here a detailed protocol for the positively charged nanogold uptake by spheroplasts followed by the visualization of these particles through a silver enhancement reaction. This method is also a valuable tool for the morphological examination of mutants with defects in endosomal trafficking. Moreover, it is not only applicable for ultrastructural examinations but it can also be combined with immunogold labelings for protein localization investigations.

Yeast, Saccharomyces cerevisiae, has been a key model organism to identify and study genes regulating the biogenesis and functions of the endosomal system. Here we present a detailed protocol for the specific labeling of the endosomal compartments for ultrastructural studies.

Nanogold Etiquetado del Sistema Endosomal Levadura de análisis ultraestructurales

Endosomes are one of the major membrane sorting checkpoints in eukaryotic cells and they regulate recycling or destruction of proteins mostly from the ...

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

Photoperiodic diapause is an important adaptation that allows individuals to escape harsh seasonal environments via a series of physiological changes, most notably developmental arrest and reduced metabolism. Global gene expression profiling via RNA-Seq can provide important insights into the transcriptional mechanisms of photoperiodic diapause. The Asian tiger mosquito, Aedes albopictus, is an outstanding organism for studying the transcriptional bases of diapause due to its ease of rearing, easily induced diapause, and the genomic resources available. This manuscript presents a general experimental workflow for identifying diapause-induced transcriptional differences in A. albopictus. Rearing techniques, conditions necessary to induce diapause and non-diapause development, methods to estimate percent diapause in a population, and RNA extraction and integrity assessment for mosquitoes are documented. A workflow to process RNA-Seq data from Illumina sequencers culminates in a list of differentially expressed genes. The representative results demonstrate that this protocol can be used to effectively identify genes differentially regulated at the transcriptional level in A. albopictus due to photoperiodic differences. With modest adjustments, this workflow can be readily adapted to study the transcriptional bases of diapause or other important life history traits in other mosquitoes.

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

RNA-Seq analyses are becoming increasingly important for identifying the molecular underpinnings of adaptive traits in non-model organisms. Here, a protocol to identify differentially expressed genes between diapause and non-diapause Aedes albopictus mosquitoes is described, from mosquito rearing, to RNA sequencing and bioinformatics analyses of RNA-Seq data.

Un Experimental y Protocolo Bioinformática para análisis de ARN-ss de fotoperiódica diapausa en el Mosquito Tigre Asiático,<em&gt; Aedes albopictus</em

Photoperiodic diapause is an important adaptation that allows individuals to escape harsh seasonal environments via a series of physiological changes, ...

Laboratory Protocol for Genetic Gut Content Analyses of Aquatic Macroinvertebrates Using Group-specific rDNA Primers

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the invasion of non-indigenous species. However, an exact identification of field predator-prey interactions is difficult in many cases. These analyses are often based on a visual evaluation of gut content or the analysis of stable isotope ratios (&#948;15N and &#948;13C). Such methods require comprehensive knowledge about, respectively, morphologic diversity or isotopic signature from individual prey organisms, leading to obstacles in the exact identification of prey organisms. Visual gut content analyses especially underestimate soft bodied prey organisms, because maceration, ingestion and digestion of prey organisms make identification of specific species difficult. Hence, polymerase chain reaction (PCR) based strategies, for example the use of group-specific primer sets, provide a powerful tool for the investigation of food web interactions. Here, we describe detailed protocols to investigate the gut contents of macroinvertebrate consumers from the field using group-specific primer sets for nuclear ribosomal deoxyribonucleic acid (rDNA). DNA can be extracted either from whole specimens (in the case of small taxa) or out of gut contents of specimens collected in the field. Presence and functional efficiency of the DNA templates need to be confirmed directly from the tested individual using universal primer sets targeting the respective subunit of DNA. We also demonstrate that consumed prey can be determined further down to species level via PCR with unmodified group-specific primers combined with subsequent single strand conformation polymorphism (SSCP) analyses using polyacrylamide gels. Furthermore, we show that the use of different fluorescent dyes as labels enables parallel screening for DNA fragments of different prey groups from multiple gut content samples via automated fragment analysis.

Most common gut content analyses of macroinvertebrates are visual. Requiring intense knowledge about morphological diversity of prey organisms, they miss soft bodied prey and, due to strong comminution of prey, are nearly impossible for some organisms, including amphipods. We provide detailed, novel genetic approaches for macroinvertebrate prey identification in the diet of amphipods.

Protocolo de laboratorio para análisis genéticos de contenido intestinal de macroinvertebrados acuáticos con grupo-específica rDNA cartillas

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the ...

Establishment of an Extracellular Acidic pH Culture System

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the role of acidic extracellular pH in tumor aggressiveness and its underlying mechanism has not been extensively studied compared to hypoxic or nutrient starvation conditions. In addition, a well-defined culture method to mimic the acidic extracellular tumor microenvironment has not been fully reported.
Here we present a simple in vitro culture method to maintain acidic extracellular pH using reduced bicarbonate and increased lactate or HCl concentrations in the culture medium. The medium pH was sustained for at least 24 h and gradually decreased by 72 h following culture of PANC-1 and AsPC-1 pancreatic cancer cells. Three distinct acidic media conditions in this study highly upregulated pH-responsive genes such as MSMO1, INSIG1, and IDI1 compared to hypoxia or nutrient starvation. The upregulation of these genes can be used as a marker of acidic pH. These simple techniques are beneficial to elucidate underlying mechanisms of tumor malignancy under acidic tumor microenvironment. Therefore, our extracellular acidic pH culture system enables discovery of cellular acidic pH responses not only in cancer cells but also in primary cells, such as renal tubular cells, in relation to the other acidic disorders including, diabetic ketoacidosis, lactic acidosis, renal tubular acidosis, and respiratory acidosis.

The acidic tumor microenvironment plays critical roles in tumor progression. To assess the effects of acidic extracellular pH on cancer cells in vitro, we established simple acidic culture systems.

Establecimiento de un pH extracelular ácido sistema de cultivo

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the ...

An Efficient In Vitro Transposition Method by a Transcriptionally Regulated Sleeping Beauty System Packaged into an Integration Defective Lentiviral Vector

The Sleeping Beauty (SB) transposon is a non-viral integrating system with proven efficacy for gene transfer and functional genomics. To optimize the SB transposon machinery, a transcriptionally regulated hyperactive transposase (SB100X) and T2-based transposon are employed. Typically, the transposase and transposon are provided transiently by plasmid transfection and SB100X expression is driven by a constitutive promoter. Here, we describe an efficient method to deliver the SB components to human cells that are resistant to several physical and chemical transfection methods, to control SB100X expression and stably integrate a gene of interest (GOI) through a &#34;cut and paste&#34; SB mechanism. The expression of hyperactive transposase is tightly controlled by the Tet-ON system, widely used to control gene expression since 1992. The gene of interest is flanked by inverted repeats (IR) of the T2 transposon. Both SB components are packaged in integration defective lentiviral vectors transiently produced in HEK293T cells. Human cells, either cell lines or primary cells from human tissue, are in vitro transiently transduced with viral vectors. Upon addition of doxycycline (dox, tetracycline analog) into the culture medium, a fine-tuning of transposase expression is measured and results in a long-lasting integration of the gene of interest in the genome of the treated cells. This method is efficient and applicable to the cell line (e.g., HeLa cells) and primary cells (e.g., human primary keratinocytes), and thus represents a valuable tool for genetic engineering and therapeutic gene transfer.

An Efficient In Vitro Transposition Method by a Transcriptionally Regulated Sleeping Beauty System Packaged into an Integration Defective Lentiviral Vector

This protocol describes a method to achieve stable integration of a gene of interest into the human genome by the transcriptionally regulated Sleeping Beauty system. Preparation of the integration of defective lentiviral vectors, the in vitro transduction of human cells, and the molecular assay on transduced cells are reported.

Un método de transposición eficiente In Vitro por un sistema de belleza durmiente transcripcionalmente regulada en un Vector lentivirales defectuosa integración

The Sleeping Beauty (SB) transposon is a non-viral integrating system with proven efficacy for gene transfer and functional genomics. To optimize the SB ...

Tissue Collection of Bats for -Omics Analyses and Primary Cell Culture

As high-throughput sequencing technologies advance, standardized methods for high quality tissue acquisition and preservation allow for the extension of these methods to non-model organisms. A series of protocols to optimize tissue collection from bats has been developed for a series of high-throughput sequencing approaches. Outlined here are protocols for the capture of bats, desired demographics to be collected for each bat, and optimized methods to minimize stress on a bat during tissue collection. Specifically outlined are methods for collecting and treating tissue to obtain (i) DNA for high molecular weight genomic analyses, (ii) RNA for tissue-specific transcriptomes, and (iii) proteins for proteomic-level analyses. Lastly, also outlined is a method to avoid lethal sampling by creating viable primary cell cultures from wing clips. A central motivation of these methods is to maximize the amount of potential molecular and morphological data for each bat and suggest optimal ways to preserve tissues so they retain their value as new methods develop in the future. This standardization has become particularly important as initiatives to sequence chromosome-level, error-free genomes of species across the world have emerged, in which multiple scientific parties are spearheading the sequencing of different taxonomic groups. The protocols outlined herein define the ideal tissue collection and tissue preservation methods for Bat1K, the consortium that is sequencing the genomes of every species of bat.

This is a protocol for the optimal tissue preparation for genomic, transcriptomic, and proteomic analyses of bats caught in the wild. It includes protocols for bat capture and dissection, tissue preservation, and cell culturing of bat tissue.

Colección de tejidos de murciélagos para análisis de émica y cultivo celular primario

As high-throughput sequencing technologies advance, standardized methods for high quality tissue acquisition and preservation allow for the extension of ...

Tobacco Hornworm as an Insect Model System for Cannabinoid Pre-clinical Studies

With increased attention on cannabinoids in medicine, several mammalian model organisms have been used to elucidate their unknown pharmaceutical functions. However, many difficulties remain in mammalian research, which necessitates the development of non-mammalian model organisms for cannabinoid research. The authors suggest the tobacco hornworm Manduca sexta as a novel insect model system. This protocol provides information on preparing the artificial diet with varying amounts of cannabidiol (CBD), setting up a cultivation environment, and monitoring their physiological and behavioral changes in response to CBD treatment. Briefly, upon receiving hornworm eggs, the eggs were allowed 1-3 days at 25 &#176;C on a 12:12 light-dark cycle to hatch before being randomly distributed into control (wheat germ-based artificial diet; AD), vehicle (AD + 0.1% medium-chain triglyceride oil; MCT oil) and treatment groups (AD + 0.1% MCT + 1 mM or 2 mM of CBD). Once the media was prepared, 1st instar larvae were individually placed in a 50 mL test tube with a wooden skewer stick, and then the test tube was covered with a cheesecloth. Measurements were taken in 2-day intervals for physiological and behavioral responses to the CBD administration. This simple cultivation procedure allows researchers to test large specimens in a given experiment. Additionally, the relatively short life cycles enable researchers to study the impact of cannabinoid treatments over multiple generations of a homogenous population, allowing for data to support an experimental design in higher mammalian model organisms.

The present protocol provides instructional information for using tobacco hornworm Manduca sexta in cannabinoid research. The method described here includes all necessary supplies and protocols to monitor physiological and behavioral changes of the insect model in response to cannabidiol (CBD) treatment.

El gusano del cuerno del tabaco como sistema modelo de insectos para estudios preclínicos de cannabinoides

With increased attention on cannabinoids in medicine, several mammalian model organisms have been used to elucidate their unknown pharmaceutical ...

Design and Implementation of a Rat Ex Vivo Lung Perfusion Model

Ex vivo lung preparations are a useful model that can be translated to many different fields of research, complementing corresponding in vivo and in vitro models. Laboratories wishing to use isolated lungs need to be aware of important steps and inherent challenges to establish a setup that is affordable, reliable, and that can be easily adapted to fit the topic of interest. This paper describes a DIY (do it yourself) model for ex vivo rat lung ventilation and perfusion to study drug and gas effects on pulmonary vascular tone, independent of changes in cardiac output. Creating this model includes a) the design and construction of the apparatus, and b) the lung isolation procedure. This model results in a setup that is more cost-effective than commercial alternatives and yet modular enough to adapt to changes in specific research questions. Various obstacles had to be resolved to ensure a consistent model that is capable of being used for a variety of different research topics. Once established, this model has proven to be highly adaptable to different questions and can easily be altered for different fields of study.

Design and Implementation of a Rat Ex Vivo Lung Perfusion Model

Ex vivo lungs are useful for a variety of experiments to collect physiological data while excluding the confounding variables of in vivo experiments. Commercial setups are often expensive and limited in the types of data they can collect. We describe a method for building a fully modular setup, adaptable for various study designs.

Diseño e implementación de un modelo de perfusión pulmonar ex vivo en ratas

Ex vivo lung preparations are a useful model that can be translated to many different fields of research, complementing corresponding in vivo and in vitro ...