Name: Video: Video Bioinformatics Analysis of Human Embryonic Stem Cell Colony Growth
Uploaded: 2010-05-20T17:00:00
Description: 12.7K vistas. University of California. Vídeo bioinformática es el tratamiento automatizado, análisis, comprensión y extracción de datos de la diversidad espacio-temporal de los datos extraídos de vídeos microscópicos. El propósito de este artículo es mostrar un método para medir humanos con células madre embrionarias crecimiento de la colonia con un método de vídeo bioinformática.

El desarrollo de este método fue posible gracias a la financiación de la relacionadas con el tabaco de California Programa de Investigación de Enfermedades, el Instituto de Medicina Regenerativa de California, y el NSF IGERT subvención en Vídeo Bioinformática (# 0903667) de la UCR ( <a href="http://www.cris.ucr.edu/IGERT/index.php">http://www.cris.ucr .edu / IGERT / index.php</a> ). Sabrina Lin es apoyado por una beca de tesis de la División de Posgrado, Shawn Forteno con el apoyo de una beca de NIH MARC, y Shruthi Satish con el apoyo de una beca de la División de Posgrado. Damos las gracias a Anna Trtchounian por su ayuda en la preparación de las cifras. También queremos agradecer a Sam Alworth y Jastromb Ned para enseñarnos cómo usar el software CL-Quant.

Parte 1: Procedimiento Experimental Los datos de vídeo contienen una gran cantidad de información. Sin embargo, esta información es a menudo difícil de extraer y cuando se hace manualmente por los seres humanos y puede requerir muchas horas de tiempo del personal para completar. Manual de análisis por los seres humanos también está sujeto a la variación en la interpretación y el error. Vídeo bioinformática implica el uso de software para minería de datos específicos a partir de imágenes de vídeo. Este método de análisis es rápida y puede eliminar el error que se produce cuando el análisis se realiza de forma manual por los seres humanos. El propósito de este artículo es mostrar un método para la cuantificación de células madre embrionarias humanas crecimiento de la colonia con un método de vídeo bioinformática. En este trabajo, el tiempo de las imágenes de vídeo lapso fueron recolectados a través de una Nikon BioStation unidad de incubación CT, que permite múltiples campos de las células para formar una imagen a través del tiempo (Fig. 1). Los métodos descritos en este informe son aplicables a los datos de video recogidas por cualquier vídeo microscópicas establecido. En nuestro diseño experimental, plateado H9 células madre en 12 y placas de cultivo de tejido durante 48 horas. Durante este intervalo, las colonias se les permitió colocar totalmente y se extendió en Matrigel. A continuación, las placas con las colonias células madre adjunta fueron trasladados a la CT BioStation y se incubaron durante 48 horas. Mientras que en el BioStation, las imágenes de las colonias se recogieron a intervalos de 7 minutos y posteriormente fueron utilizados para crear lapso de tiempo las secuencias de vídeo. Videos de cada colonia se han analizado para cuantificar el crecimiento de colonias de vídeo utilizando recetas bioinformática desarrollados con el software CL-Quant. Los análisis realizados con recetas creadas con el software CL-Quant se comprueba la veracidad manualmente con Adobe Photoshop. Parte 2: Preparación de las colonias de células madre adjunta <ol><li> Crecer células madre en Matrigel recubierto placas de 6 pocillos, y una vez llegado a la confluencia del 70% es, replate un pocillo de la placa de 6 pocillos en 5 pozos de 12 y placa recubierta de Matrigel de la siguiente manera. </li><li> Aspirar medio de un pozo que contiene células madre. </li><li> Enjuague bien con 2x 1 ml de PBS. </li><li> Añadir 1 ml de Accutase e incubar durante 1 minuto a 37 ° C y 5% de CO 2. </li><li> Añadir 10-12 perlas de vidrio en el pozo y agitar suavemente la placa por completo hasta que las colonias se desprenden de la parte inferior del pozo. </li><li> Neutralizar Accutase con 1 ml de mTeSR medio o medio MEF acondicionado. </li><li> Se centrifuga la suspensión celular en un tubo cónico de 15 ml a 200 g por 3 minutos. </li><li> Se decanta el sobrenadante y el precipitado romper con 500μl de medio mTeSR fresco. </li><li> Placa 100μl gota a gota de la suspensión de células madre en cada pocillo de una placa de 12 pocillos. </li><li> Placa de roca de ida y vuelta con cuidado y observar cultivos bajo un microscopio de luz. Asegúrese de que grupos de células se distribuyen uniformemente a lo largo de la placa. </li><li> Vuelva a colocar la placa de 12 pocillos en la incubadora. </li><li> Permitir células madre para unir y crecer durante 48 horas (un tiempo más corto puede ser utilizado). </li><li> Después de 48 horas, los pozos se decanta el medio y lavar con 500 ul de PBS para eliminar las células sueltas. </li><li> Añadir 1 ml de medio mTeSR a cada pocillo. </li><li> Comentario: Colocar la placa en la incubadora / microscopio en busca de imágenes de vídeo. </li><li> Comenzar a recopilar imágenes con lapso de tiempo. Trate de seleccionar los campos con discretas colonias aisladas que no tienen posibilidades de crecer en otras colonias. </li><li> Otros métodos para el cultivo y la creación de células madre se pueden utilizar en lugar del protocolo anterior. </li></ol> Parte 3: Vídeo Bioinformática CL-Quant de software se utiliza para crear tres &quot;recetas&quot; que cuando se ejecuta en secuencia determinará el número de píxeles o el área en micras para cada colonia con el tiempo. Las tres recetas se basan en la secuencia y para esta aplicación son la segmentación, la mejora y medición. Análisis del crecimiento de colonias células madre utilizando el software CL-Quant / desarrollo de recetas: <ol><li> La receta de segmentación se crea en primer lugar. </li><li> Escanear el vídeo entero para asegurarse de que el vídeo se puede utilizar. Compruebe que toda la colonia se queda en el campo de visión y que otras colonias no entran en el campo. </li><li> Abra el asistente de segmentación y haga clic en el botón &quot;Siguiente&quot;. </li><li> Seleccione el canal de la imagen correcta (es decir, la fase verde, rojo, etc) y haga clic en el botón &quot;Siguiente&quot;. </li><li> Pick &quot;juego suave&quot; de las 3 opciones y haga clic en &quot;siguiente&quot;. </li><li> Seleccione &quot;quieren&quot; las regiones con un círculo las regiones en la imagen general, el borde exterior de la colonia a la zona central de la colonia. <ul><li> Esta área debe ser lo más pequeña posible, pero debe ser representativo de toda la colonia. </li><li> Cuando se utiliza la microscopía de contraste de fase, asegúrese de incluir el halo alrededor de la colonia para la selección precisa de colonias por el software. </li><li> Elige una o dos regiones de interés que pueden mostrar diferentespatrones de pixeles dentro de la colonia, pero no recoge muchos &quot;quiere&quot; que puede resultar en la aplicación de la máscara inexacta. </li></ul></li><li> Haga clic en el botón &quot;Siguiente&quot;. </li><li> Seleccione &quot;No quiero&quot;, las regiones con un círculo en la imagen de las regiones que no forman parte de la colonia y no forman parte del fondo. Estas son las regiones que tienen patrones que desea suprimir e incluir píxeles de artefactos tales como los desechos y células muertas. Haga clic en &quot;siguiente&quot;. </li><li> Seleccione &quot;fondo&quot; con un círculo las regiones que desea suprimir. <ul><li> El &quot;no quiero&quot; y &quot;de fondo&quot; las regiones se diferencian en que el fondo debe ser uniforme y probabilidad de aparecer en cada marco. </li><li> Normalmente, se selecciona el fondo de color gris alrededor de la colonia. </li></ul></li><li> Haga clic en el botón &quot;Siguiente&quot;. </li><li> Una máscara de color se debe mostrar en la región de interés (Fig. 2A). </li><li> Si la máscara no se precisa cubrir la región de interés, el rango del umbral de segmentación (que se encuentra en la esquina inferior derecha de la pantalla del software) puede ser aumentado o disminuido. </li><li> El asistente le pedirá la segmentación para afinar aún más fina máscara de área si es necesario. </li><li> Si usted desea cambiar de máscara, seleccione &quot;Actualización suave regiones con el tema&quot;. Esto le permite cambiar el &quot;querer&quot;, &quot;no quiero&quot;, o las zonas &quot;de fondo&quot;. </li><li> Si la máscara es satisfactoria, seleccione &quot;solicitar umbral y salvar a mi máscara&quot;, y haga clic en el botón &quot;Siguiente&quot;. </li><li> La máscara se mostrará en un color diferente. </li><li> Seleccione &quot;Finalizar&quot;. </li><li> La receta se debe mostrar en la esquina superior derecha del software, y que debería ser llamado &quot;receta de la segmentación&quot;. </li><li> Cambiar el nombre de la receta, si lo desea haciendo clic derecho y &quot;rename&quot;. </li><li> Para comprobar in situ, haga clic derecho y colocar el puntero del ratón sobre &quot;aplicar la receta&quot;. </li><li> Un menú aparecerá que le permite seleccionar el número de fotogramas que desea utilizar al lugar el control de la receta. Ejecutar la receta de cada 10 marcos para comprobar in situ la exactitud de la colocación de la máscara. </li><li> Si la máscara recoge piezas de pequeñas regiones no deseados o basura, se puede crear una &quot;receta de mejora&quot; para mejorar la colocación de la máscara de la región de interés. </li><li> Para crear una fórmula de mejora, haga clic con la &quot;receta de mejora&quot; carpeta y haga clic en &quot;nuevo&quot;. Una receta nueva mejora se debe mostrar. </li><li> Desde el campo original de visión (FOV), haga clic en la &quot;mejora cambia el módulo&quot; situado a la derecha de la imagen. Ratón encima de los iconos en la barra de herramientas para identificar la correcta. </li><li> Seleccione &quot;etiquetado&quot; en el menú desplegable. </li><li> Seleccione &quot;4 de etiquetado conectado&quot;. </li><li> Seleccione &quot;etiquetado 4 connected2&quot;. </li><li> Una nueva barra de tareas se debe mostrar. </li><li> Coge la máscara inicial (mask0) de la receta de segmentación y arrastrarlo a la &quot;entrada&quot;. </li><li> La barra debería mostrar ahora &quot;máscara de entrada #&quot;. </li><li> Arrastre el icono de la &quot;máscara de entrada #&quot; al icono de la máscara de 0. </li><li> Encontrar el &quot;tamaño mínimo&quot; en la barra de tareas y ajustar el número hasta la región de interés sólo se muestra. Asegúrese de hacer clic en &quot;ejecutar&quot; a través de cada ensayo de montaje. </li><li> Una vez que esté satisfecho con el ajuste de tamaño mínimo, haga clic en la &quot;receta de mejora&quot; que ha creado previamente. (Fig. 2B) </li><li> En la parte inferior de la pantalla, seleccione &quot;guardar la receta&quot;. </li><li> El software ahora le pide a &quot;sobrescribir receta seleccionada?&quot;, Seleccione &quot;sí&quot; </li><li> Comprobar in situ la receta de mejora utilizando los mismos procedimientos que el anterior para la segmentación de punto de comprobación. </li><li> Si está satisfecho con la segmentación y la mejora de las recetas, seleccione &quot;crear una plantilla de medición&quot; en la barra de herramientas de mano derecha. </li><li> Cambiar el nombre de la plantilla si lo desea. </li><li> En la ventana de la plantilla de medición, mueva el cursor sobre la figura de células clipart. Mantenga presionada la tecla Ctrl y seleccione la celda. </li><li> Desactive la opción por defecto de los parámetros &quot;y&quot; del área de parámetros &quot;de verificación en« morfología ». </li><li> Exit &#39;plantilla&#39; de la ventana. </li><li> Seleccione el icono creado en la receta de medición. </li><li> Cambiar el nombre de la receta. </li><li> Desplazarse y seleccionar pestaña &quot;Plantilla&quot; en la esquina superior derecha. </li><li> Arrastre y suelte su plantilla creada previamente la medición en la ventana de medición. </li><li> Haga clic en &#39;Sí&#39; para continuar. </li><li> En la ventana de la receta de medición, seleccione &quot;Canal asignaciones&quot;, &quot;células enteras &#39;, entonces. </li><li> Seleccione &#39;Máscara de asignaciones &quot;. </li><li> Entonces &#39;de células enteras &quot;seleccione la opción de máscara mejorada. </li><li> Seleccione la &quot;receta de medición&quot; en la pestaña de recetas en la ventana principal. </li><li> Seleccione la opción &quot;Guardar&quot; icono en la ventana de recetas de medición. </li><li> A continuación, cierre la ventana. </li><li> Ahora bien, cerrar y reabrir el &#39;campo de visión. </li><li> Haga clic en la &#39;receta&#39; icono &#39;lista de bloqueo receta &quot;seleccionar y ejecutar las recetas de forma secuencial en los datos de vídeo. </li></ol> Parte 4: Comprobación de la precisión de recetas utilizando el software Photoshop Con el fin de validar la receta creada con (CL-Quant softwson), los mismos datos se pueden analizar de forma manual con Adobe Photoshop. Para este análisis, cada fotograma 10 (70 min cada punto del tiempo) fue analizada para medir el tamaño de la colonia de más de 48 horas. <ol><li> Abrir un cuadro de una imagen de la colonia en Adobe Photoshop. </li><li> Haga clic en la herramienta Varita mágica en la barra de herramientas. </li><li> Haga clic en el área alrededor de la colonia por lo que el campo está cubierto excepto la región de colonia. </li><li> Haga clic en &#39;Editar en modo Máscara rápida &quot;en la barra de herramientas y haga clic en la colonia por lo que la colonia se ha seleccionado. </li><li> Asegúrese de que la línea de puntos alrededor de la colonia encaja perfectamente en la periferia de la colonia y no en su interior. Si la línea de puntos no está en la periferia, cambie el valor de tolerancia en la barra de herramientas superior en consecuencia. </li><li> Ir a la &quot;ventana&quot; del menú desplegable y haga clic en &quot;Histograma&quot;. </li><li> Anote el valor del píxel cuando cache = 1. Si la caché es de 2, haga clic en el &#39;!&#39; a cambio de un caché, y anote el valor del píxel. </li><li> Repita el proceso anterior para cada fotograma 10. Menos cuadros en total se pueden utilizar si lo desea. </li><li> Los datos recolectados a través de Photoshop y el software CL-Quant se pueden trazar en conjunto. Si las recetas CL-Quant son veraces, las curvas para el análisis de Photoshop y CL Quant-deben ser muy similares (Figs. 3-5). </li><li> Si las recetas desarrolladas con CL-Quant son veraces, se pueden aplicar a los datos de forma fiable de vídeo. </li><li> El valor en el uso de la bioinformática de vídeo en este análisis es que una vez que la segmentación, la mejora, y las recetas de medición se han desarrollado y validado, que se llevará a cabo el análisis mucho más rápidamente y con mayor precisión que un ser humano con Photoshop. </li></ol> Resultados representante <img src="/files/ftp_upload/1933/1933fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1: Tira de película de una colonia de células madre que muestra imágenes en distintos momentos durante las 48 horas de crecimiento en un CT BioStation. Marcos fueron tomadas en intervalos de 7 minutos. <img src="/files/ftp_upload/1933/1933fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2: (A) Imagen de una células madre con una máscara que se coloca en la colonia por la receta de la segmentación. Zonas de escombros y de fondo también son enmascarados lo que indica que una receta de la mejora es necesaria para mejorar la precisión de la evaluación. (B) Imagen de la misma colonia, como se muestra en &quot;A&quot; después de la mejora se ha realizado. La máscara de ahora sólo selecciona la colonia y el ruido ha sido eliminado de la selección. <img src="/files/ftp_upload/1933/1933fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3: Gráfico que muestra el aumento de tamaño de la colonia (en píxeles) más de 48 horas como se determina utilizando CL-Quant de software y Photoshop. Este gráfico muestra los datos en bruto y muestra que las colonias empiezan en diferentes tamaños. También muestra que los dos métodos de medición están en buen acuerdo. <img src="/files/ftp_upload/1933/1933fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4: Gráfico que muestra los mismos datos que en la Figura 3 después de la normalización para mostrar el porcentaje de incremento en el tamaño de la colonia de más de 48 horas. Esto demuestra que las tasas de crecimiento son similares, independientemente del tamaño de la colonia de partida y que tanto las medidas de análisis dan resultados similares. <img src="/files/ftp_upload/1933/1933fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5: Gráfico que muestra los medios para que los datos normalizados en la Figura 4. Este gráfico muestra una buena concordancia entre los análisis realizados utilizando el vídeo bioinformática (CL-Quant de software) y Photoshop, y establece que la receta es la verdad. La ligera disminución en el área para los datos de Photoshop en el fotograma 325 se debe a varios videos que no se incluyeron en el análisis de Photoshop.

Vídeo herramientas bioinformáticas son potentes para la rápida extracción de datos de imágenes de vídeo. Nuestro protocolo para cuantificar el crecimiento de células madre colonia demuestra una aplicación de vídeo de bioinformática para un problema biológico. Este método es cuantitativo y tiene la característica interesante de los datos que revelan de las colonias de células madre individuales. Vídeo recetas bioinformática se pueden desarrollar para controlar otros procesos celulares como la proliferaci?...

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>mTeSR1 Human Embryonic Stem Cell Maintenance Medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Stem Cell Technologies</td>
<td>05850</td>
<td>or any suitable medium for hESC culture.</td>
</tr>
<tr>
<td>BD Matrigel</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Bioscience</td>
<td>356234</td>
<td>or other suitable substrate.</td>
</tr>
<tr>
<td>DMEM/F12 Basal Medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11330-032</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phosphate Buffered Saline without Ca2+ and Mg2+</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Accutase Enzyme Cell Detachment Medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>eBioscience</td>
<td>00-4555-56</td>
<td>or other suitable detachment enzyme.</td>
</tr>
<tr>
<td>3mm Glass beads</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>11-312A</td>
<td>optional.</td>
</tr>
<tr>
<td>12-well Tissue Culture Plates</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>353043</td>
<td>or any other plate format.</td>
</tr>
<tr>
<td>Nikon BioStation CT/IM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>or other incubator/microscope suitable for collecting video data.</td>
</tr>
<tr>
<td>CL-Quant software (Nikon) and/or Photoshop (Adobe).</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

video bioinformatics analysis of human embryonic stem cell colony growth

Dado que los datos de vídeo son complejos y están compuestos de muchas imágenes, información de la minería de material de video es difícil de hacer sin la ayuda de programas informáticos. Vídeo bioinformática es un poderoso método cuantitativo para la extracción de datos espacio-temporales de las imágenes de vídeo con software de computadora para realizar la minería de data y el análisis. En este artículo, presentamos un método de vídeo bioinformática para cuantificar el crecimiento de las células madre embrionarias humanas (células madre) mediante el análisis de vídeos con lapso de tiempo recogido en una Nikon BioStation CT incubadora equipado con una cámara para obtener imágenes de video. En nuestros experimentos, las colonias de células madre que se adjunta a Matrigel se filmó durante 48 horas en el CT BioStation. Para determinar la tasa de crecimiento de estas colonias, las recetas fueron desarrollados usando CL-Quant de software que permite a los usuarios para extraer distintos tipos de datos de imágenes de vídeo. Para evaluar con precisión el crecimiento de colonias, tres recetas fueron creadas. La primera segmentación de la imagen en la colonia y el fondo, la segunda mayor de la imagen para definir las colonias a lo largo de la secuencia de vídeo con precisión, y el tercero mide el número de píxeles en la colonia con el tiempo. Las tres recetas se ejecutan en una secuencia de vídeo en datos recogidos en un CT BioStation para analizar la tasa de crecimiento de colonias de células madre individuales de más de 48 horas. Para comprobar la veracidad de las recetas CL-Quant, los mismos datos fueron analizados de forma manual utilizando el software Adobe Photoshop. Cuando los datos obtenidos mediante las recetas CL-Quant y Photoshop se compararon los resultados fueron prácticamente idénticos, lo que indica la receta CL-Quant eran veraces. El método descrito aquí se podría aplicar a los datos de vídeo para medir las tasas de crecimiento de las células madre u otras células que crecen en las colonias. Además, otra de vídeo recetas de la bioinformática se pueden desarrollar en el futuro para otros procesos celulares como la migración, la apoptosis y la adhesión celular.

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Video Bioinformatics Analysis of Human Embryonic Stem Cell Colony Growth

Vídeo bioinformática es el tratamiento automatizado, análisis, comprensión y extracción de datos de la diversidad espacio-temporal de los datos extraídos de vídeos microscópicos. El propósito de este artículo es mostrar un método para medir humanos con células madre embrionarias crecimiento de la colonia con un método de vídeo bioinformática.

Vídeo Bioinformática Análisis de Crecimiento Humano Colonia células madre embrionarias

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer ...

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Research

JoVE Journal

Biology

12.7K vistas.  University of California. Vídeo bioinformática es el tratamiento automatizado, análisis, comprensión y extracción de datos de la diversidad espacio-temporal de los datos extraídos de vídeos microscópicos. El propósito de este artículo es mostrar un método para medir humanos con células madre embrionarias crecimiento de la colonia con un método de vídeo bioinformática.

Video: Video Bioinformatics Analysis of Human Embryonic Stem Cell Colony Growth

Passaging HuES Human Embryonic Stem Cell-lines with Trypsin.

In this video we demonstrate how our lab routinely passages HuES human embryonic stem cell lines with trypsin.  Human embryonic stem cells are artifacts of cell culture, and tend to acquire karyotypic abnormalities with high population doublings.  Proper passaging is essential for maintaining a healthy, undifferentiated, karyotypically normal HuES human embryonic stem cell culture.  First, an expanding culture is washed in PBS to remove residual media and cell debris, then cells are overlaid with a minimal volume of warm 0.05% Trypsin-EDTA.  Trypsin is left on the cells for up to five minutes, then cells are gently dislodged with a 2mL serological pipette.  The cell suspension is collected and mixed with a large volume of HuES media, then cells are collected by gentle centrifugation.  The inactivated trypsin media mixture is removed, and cells resuspended in pre-warmed HuES media.  An appropriate split ratio is calculated (generally 1:10 to 1:20), and cells re-plated onto a 1-2 day old plate containing a monolayer of irradiated mouse embryonic fibroblast feeder cells.  The newly seeded HuES culture plate is left undisturbed for 48 hrs, then media is changed every day thereafter.  It is important not to trpsinize down to a single cell suspension, as this increases the risk of introducing karyotypic abnormalities.

In this video we demonstrate how our lab routinely passages HuES human embryonic stem cell lines with trypsin. Brought to you by JoVE.

HUES pases madre de embriones humanos líneas celulares con tripsina

In this video we demonstrate how our lab routinely passages HuES human embryonic stem cell lines with trypsin.  Human embryonic stem cells are artifacts ...

Investigación

Biología

Propagation of Human Embryonic Stem (ES) Cells

Propagation of Human Embryonic Stem ES Cells

Propagación de la madre embrionarias humanas (ES) Células

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are derived from the blastocyst of the early embryo and are pluripotent in differentiative ability.  Their vast differentiative potential has made them the focus of much research centered on deducing how to coax them to generate clinically useful cell types.  The successful derivation of hematopoietic stem cells (HSC) from mouse ESC has recently been accomplished and can be visualized in this video protocol.  HSC, arguably the most clinically exploited cell population, are used to treat a myriad of hematopoietic malignancies and disorders.  However, many patients that might benefit from HSC therapy lack access to suitable donors.  ESC could provide an alternative source of HSC for these patients.  The following protocol establishes a baseline from which ESC-HSC can be studied and inform efforts to isolate HSC from human ESC.  In this protocol, ESC are differentiated as embryoid bodies (EBs) for 6 days in commercially available serum pre-screened for optimal hematopoietic differentiation.  EBs are then dissociated and infected with retroviral HoxB4.  Infected EB-derived cells are plated on OP9 stroma, a bone marrow stromal cell line derived from the calvaria of  M-CSF-/- mice, and co-cultured in the presence of hematopoiesis promoting cytokines for ten days.  During this co-culture, the infected cells expand greatly, resulting in the generation a heterogeneous pool of 100s of millions of cells.  These cells can then be used to rescue and reconstitute lethally irradiated mice.

This protocol details the derivation of transplantable hematopoietic stem cells from mouse embryonic stem cells (ESC) and their subsequent injection into lethally irradiated recipient mice. Briefly, ESC are differentiated as embryoid bodies, which are then infected with retroviral HoxB4 and co-cultured with OP9 stromal cells and hematopoietic cytokines.

Derivación de células madre hematopoyéticas de células madre embrionarias murinas

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass. 


The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass.

Derivación de células estaminales embrionarias humanas por Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are characterized by two fundamental properties: self-renewal and multipotency that allows a stem cell to differentiate into virtually any cell type 1. The progression stem cell to differentiated cell is characterized by loss of multipotency, structural and morphological changes and the hierarchic activity of transcription factors and signaling molecules, whose activities establish and maintain cell-type specific gene expression patterns. At the molecular level, cell differentiation involves dynamic changes of the structure and composition of chromatin and the detection of those dynamic changes can provide valuable insights into the functional features of stem cells and the cell differentiation process 2,3. Chromatin is a highly compacted DNA-protein complex that forms when cells package chromosomal DNA with proteins, mainly histones 4. Stemcellness and cell differentiation has been correlated with the presence of specific arrays of regulatory proteins such as epigenetic factors, histone variants, and transcription factors 2,3,5.
 Chromatin immunoprecipitation (ChIP) provides a valuable method to monitor the presence of RNA, proteins, and protein modifications in chromatin 6,7. The comparison of chromatin from different cell types can elucidate dynamic changes in protein-chromatin associations that occur during cell differentiation.
Chromatin immunoprecipitation involves the purification of in vivo cross-linked chromatin. The isolated chromatin is reduced to smaller fragments by enzymatic digestion or mechanical force. Chromatin fragments are precipitated using specific antibodies to target proteins or protein and DNA modifications. The precipitated DNA or RNA is purified and used as a template for PCR or DNA microarray based assays. Prerequisites for a successful ChIP are high quality antibodies to the desired antigen and the availability of chromatin from control cells that do not express the target molecule. ChIP can correlate the presence of proteins, protein and RNA modifications, and RNA with specific target DNA, and depending on the choice of outread tool, detects the association of target molecules at specific target genes or in the context of an entire genome. The comparison of the distribution of proteins in the chromatin of differentiating cells can elucidate the dynamic changes of chromatin composition that coincide with the progression of cells along a cell lineage.

The differentiation of ESC coincides with cell-type specific changes in the structure and composition of chromatin. The detection of those changes provides valuable insights into the mechanisms that define stemcellness and cell differentiation. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) represents a valuable method to dissect the molecular mechanisms underlying stem cell differentiation.

Inmunoprecipitación de la cromatina de células estaminales embrionarias humanas

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells  

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be  fed  every day by performing a complete medium change to replenish lost nutrients and to keep the cultures free of unwanted differentiation factors. Although a small amount of differentiation is normal and expected in stem cell cultures, the culture should be routinely cleaned up by manually removing, or "picking" differentiated areas. Identifying and removing excess differentiation from hES cell cultures are essential techniques in the maintenance of a healthy population of cells.

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells

This protocol demonstrates how to maintain healthy, undifferentiated human embryonic stem (ES) cells.

La cultura y el mantenimiento de células estaminales embrionarias humanas

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be ...

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult human peripheral blood within a mean of 12 days. After large scale expansion &gt;1x108 ECFCs can be obtained for further tests. Advantageously by using pHPL the contact of human cells with bovine serum antigens can be excluded. By flow cytometry and immunohistochemistry the isolated cells can be characterized as ECFC and their in vitro functionality to form vascular like structures can be tested in a matrigel assay. Further these cells can be subcutaneously injected in a mouse model to form functional, perfused vessels in vivo. After long term expansion and cryopreservation proliferation, function and genomic stability appear to be preserved. 3,4
This animal-protein free isolation and expansion method is easily applicable to generate a large quantity of ECFCs.

Endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) are a promising tool to study vascular homeostasis and repair.1,2 This paper introduces a novel animal-serum free method for isolation and expansion of ECFC from heparinised adult human peripheral blood with pooled human platelet lysate (pHPL) diminishing the risk of anti-bovine immunisation.

El aislamiento y la expansión a gran escala de células humanas adultas Colonia progenitoras endoteliales formación

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells (ECFCs)

The umbilical cord is a rich source for progenitor cells with high proliferative potential including mesenchymal stromal cells (also termed mesenchymal stem cells, MSCs) and endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs). Both cell types are key players in maintaining the integrity of tissue and are probably also involved in regenerative processes and tumor formation.
To study their biology and function in a comparative manner it is important to have both cells types available from the same donor. It may also be beneficial for regenerative purposes to derive MSCs and ECFCs from the same tissue.
Because cellular therapeutics should eventually find their way from bench to bedside we established a new method to isolate and further expand progenitor cells without the use of animal protein. Pooled human platelet lysate (pHPL) replaced fetal bovine serum in all steps of our protocol to completely avoid contact of the cells to xenogeneic proteins.
This video demonstrates a methodology for the isolation and expansion of progenitor cells from one umbilical cord.
All materials and procedures will be described.

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells MSCs and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells ECFCs

This protocol describes the isolation and subsequent expansion of mesenchymal stromal cells and endothelial colony forming cells without the use of animal serum to generate autologous pairs for experimental transplantation purposes.

Aislamiento y suero animal expansión libre de cordón umbilical humano derivado de células mesenquimales del estroma (MSC) y endoteliales formadoras de colonias Células Progenitoras (ECFCs)

The umbilical cord is a rich source for progenitor cells with high proliferative potential including mesenchymal stromal cells (also termed mesenchymal ...

Freezing and Thawing Human Embryonic Stem Cells

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

Congelación y descongelación células estaminales embrionarias humanas

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant interest in deriving a pure population of lineage-committed oligodendrocyte precursor cells (OPCs) for transplantation. OPCs are characterized by the activity of the transcription factor Olig2 and surface expression of a proteoglycan NG2. Using the GFP-Olig2 (G-Olig2) mouse embryonic stem cell (mESC) reporter line, we optimized conditions for the differentiation of mESCs into GFP+Olig2+NG2+ OPCs. In our protocol, we first describe the generation of embryoid bodies (EBs) from mESCs. Second, we describe treatment of mESC-derived EBs with small molecules: (1) retinoic acid (RA) and (2) a sonic hedgehog (Shh) agonist purmorphamine (Pur) under defined culture conditions to direct EB differentiation into the oligodendroglial lineage. By this approach, OPCs can be obtained with high efficiency (&gt;80%) in a time period of 30 days. Cells derived from mESCs in this protocol are phenotypically similar to OPCs derived from primary tissue culture. The mESC-derived OPCs do not show the spiking property described for a subpopulation of brain OPCs in situ. To study this electrophysiological property, we describe the generation of spiking mESC-derived OPCs by ectopically expressing NaV1.2 subunit. The spiking and nonspiking cells obtained from this protocol will help advance functional studies on the two subpopulations of OPCs.

We describe a small molecule-based protocol for differentiation of mouse embryonic stem cells into oligodendrocyte precursor cells (OPCs). This protocol generates Olig2+NG2+ OPCs with high efficiency by 30 days of differentiation. We also describe a method to generate "spiking" OPCs that can fire action potentials.

La diferenciación de células madre embrionarias en los precursores de oligodendrocitos

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...