Active todos los componentes de configuración de adquisición para la medición de la fluorometría. Coloque el plato de fondo de vidrio de 35 milímetros que contiene las fibras musculares disociadas en el escenario del microscopio. Retire cuidadosamente el medio de cultivo con una pipeta de 1.000 microlitros y reemplácelo con 2 mililitros de solución de timbre a temperatura ambiente.
Usando un manipulador mecánico o motorizado, coloque los dos cables de platino perpendiculares al fondo del plato. Asegúrese de que los terminales del electrodo estén alineados en relación con el eje longitudinal de la fibra y a unos pocos milímetros de los extremos de la fibra. Ajuste la posición del electrodo girando el plato o moviendo cada electrodo si está montado en un micromanipulador independiente.
Encienda la luz transmitida y encuentre las fibras en el campo de visión utilizando un objetivo de 20X. Mueva el cubo de filtro EGFP hacia el camino de la luz. Después de apagar la luz transmitida, active la luz de excitación de 488 nanómetros con un obturador de luz controlado a distancia.
Para identificar las fibras positivas de EGFP, centre las fibras con la señal EGFP más brillante en el centro del campo de visión. Use un diafragma colocado en la trayectoria de la luz de excitación para enfocar la luz de excitación en un área específica de la fibra. Esto permite la adquisición de señal, donde la señal EGFP CaV1.1 es máxima.
Ajuste la posición de la fibra con la etapa mecánica para alinearla con la trayectoria de la luz del diafragma y almacene la ubicación XY de la fibra. Después de regresar a la primera localización guardada, establezca la duración de dos pulsos de estimulación secuencial en 1 milisegundo, la amplitud en 20 voltios y la polaridad de los pulsos en alternancia. Luego, use un interruptor de disparo manual para administrar los dos pulsos secuenciales.
Durante la estimulación, observe dos contracciones concéntricas de fibras homogéneas en respuesta a los dos pulsos de polaridad opuesta. Si no se observa ninguna contracción o solo una contracción concéntrica con pulsos de polaridad alternos, descarte las fibras del resto del experimento. Agregue 2 microlitros de solución de 10 milimolar MTS 5 TAMRA directamente en el plato y mezcle suavemente con una pipeta de 1, 000 microlitros.
Incubar durante cuatro a cinco minutos para permitir la difusión de la molécula de tiol fluorescente en el lumen del sistema tubular transversal. A través de la estimulación de campo, aplique estimulaciones repetitivas bipolares para evocar trenes de potencial de acción sucesivos a una velocidad de 50 hercios durante 300 milisegundos cada 1 segundo durante 5 minutos. Retire la solución de tinción del plato con una pipeta de 1, 000 microlitros.
Y reemplácelo con 2 mililitros de solución de timbre a temperatura ambiente. Deje que la fibra teñida se recupere del protocolo de tinción durante al menos 10 minutos. Después de reevaluar la salud de la fibra y la actividad eléctrica con dos pulsos alternos, mueva el cubo de filtro MTS 5 TAMRA a la vía de luz y active la luz de excitación de 533 nanómetros con un obturador de luz controlado a distancia para confirmar visualmente la tinción en las fibras.
A continuación, utilizando la ubicación almacenada en la etapa motorizada, coloque la fibra en el centro del campo con el cubo de filtro MTS 5 TAMRA, el diafragma y el objetivo de inmersión en aceite 60X. Después de reorientar los cables de platino de estimulación de campo en cada extremo de la fibra, alinee los cables en el eje principal de las fibras en línea recta y espaciarlos a cinco milímetros de distancia, con la fibra en el centro. En el software de adquisición, seleccione el protocolo que se utilizará para la adquisición.
Este paso se controla solo con la computadora y activa todos los dispositivos posteriores para la estimulación eléctrica y el control del obturador de la trayectoria de la luz. Para cada protocolo, minimice el tiempo total de adquisición tanto como sea posible para evitar el blanqueamiento de la señal, pero permita unas pocas decenas de milisegundos de iluminación de luz y adquisición de señal antes de la primera estimulación eléctrica para registrar una línea de base. Ejecute el protocolo presionando Ejecutar.
La señal grabada se muestra automáticamente en la pantalla. La pequeña amplitud de la señal y la rápida contracción mecánica de la fibra a menudo ocultan la mayor parte de la señal y muestran un artefacto de movimiento. Agregue 1 micromolar de 100 milimolares y benzoilo para tolueno sulfonamida a la solución de grabación para minimizar las respuestas contractuales y distinguir aún más la señal que surge de los movimientos S4 debido a la activación de la fibra.
Después de unos minutos, ejecute el mismo protocolo por segunda vez. El artefacto de movimiento ahora se elimina, pero queda un pequeño cambio de fluorescencia correspondiente al movimiento S4. Mueva el plato ligeramente usando la etapa mecánica para adquirir una señal de un área sin fibras ni residuos.
Ejecute el protocolo una última vez para registrar la fluorescencia de fondo. Exporte las trazas y use un programa de hoja de cálculo para expresar la señal como delta f sobre f 0 en función del tiempo, y aplique la corrección de línea base si es necesario. Aquí se muestran ejemplos de imágenes transmitidas y fluorescentes del músculo diseccionado y no disociado que expresan una construcción EGFP CaV1.1.
Las imágenes representativas de una fibra muscular que expresa una construcción EGFP CaV1.1 VS D3 antes y después de la tinción MTS 5 TAMRA se muestran en esta figura. Este colorante también tiñe cisteínas endógenas de fibras no transfectadas. Las imágenes confocales de una construcción EGFP CaV1.1 VS D3 y tinción MTS 5 TAMRA muestran un patrón de doble banda característico de la localización de CaV1.1 en el sistema de túbulos transversales de la fibra muscular.
Aquí se muestra la grabación fluorométrica representativa en respuesta a dos estímulos y medida con un fotodiodo. Ambas señales se normalizan por su valor mínimo y se trazan en función del tiempo en relación con su respectiva despolarización. Estas grabaciones muestran que la fase ascendente y el tiempo hasta el pico de la señal son similares para ambas despolarizaciones impuestas a la fibra.
