Para comenzar, tome la placa de fibroblastos electroporados y observe la formación de colonias de hiPSC bajo un microscopio de contraste de fase objetivo de 10x a 20x. Las colonias hiPSC con 300 micrómetros de diámetro, bordes distintos y una alta relación núcleo/cuerpo son adecuadas para la recolección. Antes de recoger, cubra los pocillos de una placa de 96 pocillos adecuada para el cultivo de hiPSC con 100 microlitros de solución de recubrimiento.
E incubar durante una hora a 37 grados centígrados. Durante la incubación, marque las colonias de interés en el fondo de la placa de cultivo celular con un bolígrafo. Para la preparación final de la placa de 96 pocillos, retire la solución de recubrimiento y agregue 100 microlitros de medio de cultivo hiPSC precalentado, que contiene 10 micromoles del inhibidor de ROCK Y-27632 a cada pocillo.
A continuación, lave las células con PBS precalentado y agregue un medio de cultivo hiPSC precalentado fresco que contenga 10 micromoles del inhibidor de ROCK Y-27632 antes de recoger para eliminar las células muertas. Escoja las colonias hiPSC con una aguja de calibre y divida las colonias en trozos pequeños dibujando una cuadrícula en cada colonia. Después, use un microscopio de contraste de fase para verificar que las colonias se dividan con éxito en pedazos.
Finalmente, transfiera las colonias con una pipeta de 100 microlitros a la placa de 96 pocillos preparada, sosteniendo la pipeta en posición vertical sobre la colonia. Permita que las células se adhieran durante la noche a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono sin perturbaciones. Al día siguiente, reemplace el medio con 200 microlitros de medio de cultivo hiPSC fresco para eliminar el inhibidor de ROCK Y-27632 y vuelva a colocar las placas en la incubadora.
Monitoree la placa de 96 pocillos y marque los pozos con clones seleccionados con éxito. Los clones marcados se pueden expandir y congelar en este punto. Las imágenes de contraste de fase han reprogramado con éxito colonias hiPSC, se presentan hiPSC seleccionadas, colonias espontáneamente diferenciadas, colonias no hiPSC y un cultivo hiPSC demasiado denso.
