Comience colocando un ratón macho sacrificado de siete a ocho semanas de edad en una superficie de banco limpia. Corte la piel abdominal del ratón con un par de tijeras hacia la parte inferior del abdomen. Extirpe el tejido adiposo de la parte interna de los muslos.
Coloque el tejido extirpado en el tubo C en hielo que contenga 2,5 mililitros de una mezcla enzimática de enzimas D, R, A y 2,35 mililitros de DMEM/F12 sin FBS ni antibióticos. Con unas tijeras, corta el tejido adiposo en aproximadamente dos trozos cuadrados de milímetro. Cierre herméticamente la tapa del tubo C e invierta el tubo.
Conecte el tubo a la manga de un disociador de tejido y digiera las muestras a 37 grados centígrados durante 40 minutos. A continuación, precaliente los medios DMEM / F12 que contienen FBS y antibióticos a 37 grados centígrados. Después de la incubación, retire el tubo C del disociador de tejido y detenga la digestión agregando cinco mililitros de DMEM / F12 con FBS y antibióticos.
Pipetear suavemente cuatro veces. Centrifugar la suspensión a 700 g durante 10 minutos a 20 grados centígrados. Sin alterar la paleta de celdas, aspire cuidadosamente el sobrenadante.
Vuelva a suspender el pellet en 10 mililitros de DMEM / F12 que contenga FBS y antibióticos, y pipetear suavemente cinco veces. Filtre la suspensión celular a través de un filtro celular de 70 micras de diámetro colocado en un tubo de 50 mililitros. Centrifugar el filtrado a 250 g durante cinco minutos.
Resuspender el pellet en 10 mililitros de PBS. Antes del recubrimiento, centrifugar la suspensión celular a 500 g durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante.
Resuspenda el pellet en 10 mililitros de DMEM / F12 que contenga FBS y antibióticos. Mezclar pipeteando la suspensión suavemente, 10 veces. Coloque 10 mililitros de la suspensión en un plato recubierto de colágeno de 10 centímetros.
Coloque el plato en una incubadora de cultivo celular. Aspirar el medio y lavar las células tres veces con tres mililitros de PBS por lavado. Agregue 10 mililitros de DMEM / F12 que contengan FBS y antibióticos e incube.
La tinción Oil Red O mostró adipocitos cargados de lípidos siete días después de inducir la diferenciación de los adipocitos. El grado de diferenciación completa fue confirmado por el análisis de expresión de ARNm de los reguladores de la adipogénesis. La rosiglitazona indujo un efecto dependiente de la dosis en los niveles de expresión de genes específicos de grasa marrón como Ucp1 y Ppargc1a.
Sin embargo, para Fabp4, el efecto saturado a 0,1 micromoles de concentración de rosiglitazona. Los adipocitos diferenciados se pueden utilizar para diversos análisis funcionales y mecanicistas, como el análisis de la tasa de consumo de oxígeno y la inmunoprecipitación de cromatina.
