Comience moliendo 10 miligramos de Mycobacterium paratuberculosis liofilizada hasta obtener un polvo fino con un mortero. Agregue cinco mililitros de adyuvante de Freund incompleto para obtener una solución madre de 10 miligramos por mililitro. Guarde el caldo a menos cuatro grados centígrados.
Antes de la inmunización, diluya la solución madre. Luego, diluya el péptido MOG 35-55 a dos miligramos por mililitro y guárdelo a menos 20 grados centígrados. Mezcle volúmenes iguales del MOG 35-55 con el adyuvante en un tubo de cinco mililitros con un homogeneizador hasta que se forme una emulsión espesa.
Después de cada 10 segundos de mezcla, coloque la solución en hielo durante 20 segundos y gire el tubo para recuperar toda la solución. Transfiera la emulsión a una jeringa de un mililitro, asegurándose de que esté libre de burbujas de aire. Luego, colóquelo con una aguja de calibre 27.
Por vía subcutánea, inyecte 200 microlitros de la emulsión en la parte inferior de la espalda de un ratón anestesiado. Luego, inyecte por vía intraperitoneal una dosis de toxina pertussis el día cero y dos después de la inmunización. Todos los ratones manifestaron una enfermedad monofásica aguda, caracterizada por un único pico de discapacidad observado a los 14 a 17 días, seguido de una recuperación parcial de los síntomas durante los siguientes 10 días.
Los ratones inmunizados con M. paratuberculosis mostraron un inicio más temprano después de la inmunización y una mayor gravedad en la fase aguda. Ambos grupos demostraron pesos corporales similares. El ensayo de proliferación con incorporación de timidina ajustada realizado en las células del bazo de ratones EAE mostró una fuerte respuesta proliferativa al péptido MOG 35-55, pero no a la ovoalbúmina.
El análisis citofluorométrico mostró un aumento de linfocitos T, células dendríticas y monocitos en el bazo de ratones EAE inmunizados con M. paratuberculosis en comparación con ratones inmunizados con CFA. El análisis de hematoxilina y tejido de eosina reveló una infiltración inflamatoria mononuclear paravascular y meníngea típica en el cerebro y la médula espinal.
