Comience el ensayo colocando la planta receptora de polen de A.thaliana etiquetada de lado, colocando la flor castrada en el escenario de un microscopio invertido para obtener imágenes del estigma. Para fijar la posición de la flor receptora castrada, inmovilice el tallo con tiras de cinta adhesiva. De la planta donante de polen, retire una flor sana y recién abierta y coloque la planta donante de polen bajo un microscopio de disección.
Reúna los granos de polen usando pinzas de punta fina. Retire el exceso de granos de polen tocando ligeramente las pinzas contra los pétalos del donante hasta que se forme la monocapa del grano de polen. Regrese a la planta receptora de polen y use una lente objetiva de baja potencia para enfocar el microscopio invertido en el estigma.
Sosteniendo los fórceps a lo largo de la abertura entre los brazos de los fórceps, acérquese cuidadosamente y no polinize la célula de la papila estigmatizada. Continúe acercándose a la célula de papila estigmatizada no polinizada hasta que el grano de polen colocado adecuadamente en las pinzas haga un ligero contacto con su superficie. Una vez que se confirme la fijación del polen, retire lentamente los fórceps.
Oriente el grano de polen con su eje ecuatorial visible y en enfoque nítido, e inmediatamente cambie a una lente de objetivo de mayor potencia, como 20x. Capture la primera imagen de grano de polen como T-0 y continúe capturando imágenes a intervalos de un minuto durante 10 minutos. Ajuste el enfoque para acomodar pequeños movimientos en el grano de polen o el estigma.
Registre la temperatura ambiente y la humedad relativa de la habitación cada dos minutos, lo que permite futuras comparaciones entre réplicas experimentales. Guarde las imágenes en un formato sin pérdida, como ND2, antes de repetir los pasos de polinización e imagen para que los granos de polen adicionales adquieran datos para el control y las polinizaciones experimentales. Comience las mediciones de datos para el ensayo de hidratación del polen utilizando un software de análisis de imágenes.
Utilice parámetros similares de zoom digital y el enfoque que define el límite de polen para todas las mediciones en los conjuntos de datos. Registre los valores del eje semisecundario para todos los puntos temporales del conjunto de datos. Una vez completadas las mediciones de un conjunto de datos, exporte los valores de eje semimenor sin procesar de cada punto de tiempo individual a una hoja de cálculo.
Presente los datos en columnas por pila de imágenes y calcule el porcentaje de cambio de eje semimenor. Repita los pasos y obtenga datos de al menos 15 granos de polen hidratados para cada línea de plantas. Algunos granos de polen pueden no hidratarse o pueden hidratarse significativamente más lento de lo esperado.
Se les conoce como granos dudosos. Excluirlos del conjunto de datos. Calcule los valores medios para cada punto de tiempo por planta utilizando el paquete de software especializado GraphPad Prism.
Analice los datos de hidratación de líneas de tipo salvaje y mutantes en cada punto de tiempo utilizando la prueba T no pareada y el ANOVA unidireccional para comparar las medias del punto de tiempo específico de interés. Para comparar las medias en todos los puntos de tiempo, realice varias pruebas T entre líneas de tipo salvaje y mutantes en varios puntos de tiempo. Los datos de series temporales de hidratación del polen para plantas de tipo silvestre recolectados en diferentes días mostraron que los valores mínimos y máximos para las medias entre réplicas para todos los puntos de tiempo estaban dentro del 3%Estos datos representativos para polinización de tipo silvestre demostraron un alto grado de consistencia para números de muestra relativamente bajos y en diferentes días.
