Use una vela de huevo para trazar a lo largo del perímetro de la bolsa de aire sobre el embrión E14 o E15 con un lápiz y cubra el área delineada con cinta transparente. Usando tijeras curvas o finas, corte suavemente alrededor del área trazada. Tenga cuidado de no cortar la membrana embrionaria o los vasos sanguíneos.
Luego deseche la pieza superior de la cáscara. Después de decapitar el embrión de pollo, coloque la cabeza en un plato de 10 centímetros con una solución fría y estéril de CMF. Usando pinzas finas estériles, retire la piel que cubre el cerebro para revelar la duramadre subyacente.
Retire los huesos del cráneo en formación en los lados izquierdo y derecho del cerebro. Los huesos del cráneo en formación aún no cubren la mayor parte del cerebro. Use suavemente pinzas puntiagudas finas para atravesar las meninges, sobre el centro del cerebro y pelarlo a cada lado para descubrir el cerebro.
Usando pinzas curvas finas, levante el cerebro desde la parte inferior frontal y sáquelo suavemente de su cavidad. Diseccionar el cerebro en sus tres partes principales prosencéfalo, mesencéfalo o tecta óptica y cerebelo. Retire la piamadre suprayacente de la tecta con pinzas finas y coloque las regiones cerebrales disecadas en un pequeño plato estéril sobre hielo.
Para incrustar y cortar el cerebro, levante suavemente el tectum óptico o la región del cerebro anterior con pinzas curvas como cuchara y seque ligeramente en una gasa estéril para eliminar el exceso de líquido. Prepare un molde simple formando papel de aluminio alrededor de un objeto del tamaño adecuado. Aquí, se utiliza como objeto un pequeño bloque de corte de tejido vibratorio de metal rectangular.
Utilice una pipeta de transferencia estéril y llene el molde con agarosa de bajo punto de fusión. Coloque rápidamente la región del cerebro en agarosa y deje que se solidifique durante aproximadamente cuatro a cinco minutos en hielo. Corte las secciones en una cortadora de tejido vibrante con un cuchillo de zafiro.
Use la espátula estéril para recoger y retirar la rebanada de la bandeja. Deslice suavemente la sección fuera de la espátula y sobre un inserto de membrana usando otra espátula estéril. Coloque la placa de seis pocillos de cortes de cerebro en insertos de membrana en la incubadora de cultivo celular a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono.
El día después del emplatado, use una pipeta estéril Pasteur para aspirar el medio desde debajo del inserto y agregue un mililitro de medio de corte fresco a cada pocillo debajo del inserto de membrana. A continuación, para introducir las células GBM en las rebanadas cerebrales, retire uno o varios esferoides de su plato de cultivo utilizando una micropipeta de 20 microlitros establecida en cinco microlitros. Expulse suavemente los medios con esferoides sobre la rebanada cerebral deseada y permita que los esferoides crezcan en la rebanada durante dos a cinco días.
Los resultados de viabilidad de los cortes de tectum óptico x vivo después de una semana en cultivo se muestran en esta figura. Las imágenes confocales de un corte cerebral teñido para núcleos con bisbenzimida e inmunoteñido para laminina muestran claramente vasos sanguíneos normales e intactos seccionados ópticamente en varias configuraciones. Aquí se muestra la imagen de proyección máxima de la pila Z confocal del corte cerebral teñido para el factor de transcripción SOX 2 y los núcleos totales con bisbenzimida.
Estos resultados sugieren que las rebanadas de cerebro de embriones de pollo podrían cultivarse en insertos de membrana durante aproximadamente dos semanas y permanecer viables con vasos sanguíneos de apariencia normal y expresión de factores de transcripción.
