Después de fijar el globo ocular enucleado del ratón sacrificado, transfiéralo a un portaobjetos de vidrio y colóquelo bajo un microscopio de disección. Con fórceps, sujete el margen de la córnea para evitar el movimiento del globo ocular. Con las tijeras de disección, corte alrededor de la córnea a una profundidad de aproximadamente un milímetro a través del limbo escleral de la córnea y luego retire la lente y el cuerpo vítreo.
Sosteniendo el disco óptico en el centro, corta la retina radialmente a lo largo de los cuatro cuadrantes, alcanzando aproximadamente 2/3 del radio de la retina. Sujete uno de los bordes esclerales con pinzas dentadas. Sostenga el borde de la esclerótica con pinzas sin dientes y muévase desde las pinzas dentadas hacia la base de la esclerótica.
Pelar cuidadosamente la retina. Mojar la retina con 200 microlitros de PBS usando una pipeta. Retire el exceso de PBS con papel absorbente y aplanar la retina con un cepillo de cerdas pequeñas si es necesario.
Agregue lentamente metanol frío gota a gota en la superficie interna de la retina hasta que se cubra por completo. Una vez que la retina se vuelva blanca y desarrolle una mayor tenacidad, aplanar suavemente la retina y eliminar las impurezas, como las membranas pigmentarias residuales y el cuerpo vítreo, con un pequeño cepillo de cerdas. Después de invertir la retina, trátela con metanol como se demostró anteriormente y transfiérala a un pocillo de placa de 24 pocillos, sumérjala en metanol y guárdela a 20 grados centígrados durante una o dos horas para una inmunotinción inmediata.
Luego enjuague la retina con PBS después de eliminar el metanol de la placa. Las células ganglionares del retinol de las retinas antes y después del tratamiento con metanol se visualizaron mediante microscopía confocal, lo que indicó que los 12 meses de preservación del metanol no afectaron la inmunotinción RGC.
