Comience aspirando los medios de las placas que contienen adherente crudo 264.7. Agregue 10 mililitros de PBS por placa de 15 centímetros. Use un raspador de células para separar las células y tirar de ellas en un solo tubo de 50 mililitros.
Pipetear la suspensión celular hacia arriba y hacia abajo para homogeneizar. A continuación, transfiera el 5% del volumen de la suspensión celular a un nuevo tubo de 1,5 mililitros. Centrifugar a 300G durante cinco minutos a temperatura ambiente.
Deseche el sobrenadante y coloque el pellet de fracción celular total en hielo. Después de centrifugar la suspensión restante como se describió anteriormente, aspire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en cinco mililitros de tampón mitocondrial helado. Centrifugar la suspensión a 300G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados.
Vuelva a suspender el pellet en 0,5 mililitros de tampón mitocondrial frío. Y transfiera la suspensión a un tubo de 1.5 mililitros. A continuación, homogeneice la suspensión, evitando que pase 30 veces a través de una aguja de calibre 25 ajustada a una jeringa de un mililitro.
Luego agregue un mililitro de tampón de mitocondrias frías al tubo y mezcle por inversión. Después de centrifugar las células, transfiera un mililitro del sobrenadante a un tubo nuevo en hielo. Vuelva a suspender el pellet en el tampón y homogeneice el pellet pasando a través de una aguja de calibre 25 instalada en una jeringa de un mililitro.
Tire de los gránulos de celda homogeneizada y el sobrenadante de los pasos anteriores en un solo tubo de 1.5 mililitros. Centrifugarlo a 2, 000G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Recoja el sobrenadante y divídalo en cuatro tubos de 1,5 mililitros.
Enrasar el volumen en cada tubo a 1,5 mililitros usando tampón mitocondrial. Invierta los tubos para mezclar su contenido y luego centrifugue los tubos. Retire con cuidado el sobrenadante y la bolita celular blanca superior.
Mantenga uno de los cuatro tubos que contienen el pellet mitocondrial marrón en hielo como una fracción mitocondrial cruda. Tire de los gránulos restantes en un tubo nuevo y haga que el volumen final sea de un mililitro con tampón mitocondrial. Usando este protocolo, las células totales y las fracciones mitocondriales crudas se obtuvieron de la línea celular de macrófagos 264.7 en bruto y BMDM.
El inmunoanálisis sanguíneo mostró que la citrato sintasa mitocondrial se enriqueció en la fracción bruta. Las proteínas del citosol, la membrana plasmática, el núcleo, el lisosoma y el retículo endoplásmico desaparecieron. El análisis del proteoma mostró un enriquecimiento de más de diez veces en la fracción bruta.
Los otros seis compartimentos celulares se agotaron durante la purificación.
