Comience transfiriendo una fracción bruta de mililitro de mitocondrias RAW 264.7 a un tubo cónico de 15 mililitros. Agregue 7 mililitros de tampón mitocondrial salado suplementado con cloruro de sodio 150 milimolar. A la suspensión, agregue 50 microlitros de perlas TOM22 y luego incube el tubo en una rueda giratoria a baja velocidad.
Coloque una columna en el imán y equilibre la columna con ocho mililitros de tampón mitocondrial salado. Deseche el flujo continuo. Después de la incubación de la muestra, transfiérala a la columna y deseche el flujo.
A continuación, lave la columna tres veces con ocho mililitros de tampón mitocondrial salado. Retire la columna del imán y colóquela en un tubo cónico de 15 mililitros. Para eluyir las mitocondrias, agregue 1.5 mililitros de tampón mitocondrial salado e inmediatamente aplique un émbolo para eluyer la fracción purificada en el tubo.
Transfiera la fracción eluyente a un nuevo tubo de 1.5 mililitros y realice la centrifugación a 21, 000G durante 10 minutos a 4 grados centígrados. Deseche el sobrenadante formado y almacene el pellet mitocondrial puro marrón a 20 grados centígrados para futuros estudios. El análisis de inmunoblot de los extractos mitocondriales purificados mostró enriquecimiento de la citrato sintasa mitocondrial y agotamiento de proteínas de otros orgánulos celulares.
Los estudios de integridad mitocondrial mediante microscopía electrónica revelaron mitocondrias con una forma ovalada clásica y crestas intactas rodeadas de perlas recubiertas de anticuerpos densos en electrones. Además, el análisis del proteoma mostró un enriquecimiento de proteínas mitocondriales y dos poblaciones distintas correspondientes a proteínas mitocondriales y no mitocondriales.
