Para comenzar, mantenga las células en un matraz de cultivo de 75 centímetros cuadrados. Aspirar el medio de cultivo y enjuagar las células con PBS sin calcio ni magnesio. A continuación, agregue dos mililitros de EDTA de tripsina al 0,25% para separar las células de adherencia.
Incubar durante cinco minutos a temperatura ambiente y resuspender las células en 10 mililitros de medio. A continuación, recoja las células del matraz en un tubo de centrífuga de 15 mililitros. Centrifugar a 480 G durante cinco minutos a temperatura ambiente y aspirar el medio.
Resuspender las células en 5 a 10 mililitros de medio en función de la confluencia original del cultivo. Retire 100 microlitros de células y agréguelos a un tubo de 1,5 mililitros con 100 microlitros de 0,4% de azul de tripano. Agregue las células al hemocitómetro y cuéntelas observando bajo el microscopio y usando el contador manual.
Diluir las células a tres veces 10 a la cuarta célula por mililitro en el medio de cultivo sin rojo fenol. Agregue 2.5 mililitros de la suspensión de celdas a cada pocillo de una placa de seis pocillos con cubreobjetos recubiertos de poli-D-lisina según las instrucciones del fabricante. Cultive las células durante la noche a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono en una incubadora humidificada para permitir la adhesión de las células al cubreobjetos.
Al día siguiente, examine la unión celular bajo un microscopio invertido con un objetivo 20X. Prepare las soluciones madre de tratamiento a las concentraciones deseadas y cree un control solo de medios, un control de solo vehículo a una concentración que coincida con el compuesto de prueba y un control con el ionóforo FCCP y los compuestos de prueba. Trabajando con un cubreobjetos a la vez, agregue 1,8 mililitros de medio para la afección en estudio a las células.
Incubar las células tratadas con el compuesto de control o de prueba a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono en un ambiente humidificado durante el tiempo deseado. Después del período de tratamiento, agregue 200 microlitros de TMRE 10X a las células. Incubar durante 15 a 30 minutos a 37 grados centígrados en un ambiente humidificado con dióxido de carbono al 5%.
Aspire suavemente el medio y enjuague las celdas dos veces con PBS para minimizar la interferencia de fondo. A continuación, invierta el cubreobjetos en un portaobjetos de microscopio etiquetado con las condiciones de tratamiento. Imagina que las células viven a 549 nanómetros de excitación y 575 nanómetros de emisión.
Utilice un microscopio confocal para capturar varios campos de pila Z con captura de imágenes de alta velocidad antes de que se pierda la integridad de la célula. Guarde y almacene el archivo de imagen para su posterior análisis. Las células con mitocondrias activas retuvieron la tinción de TMRE y mostraron una alta fluorescencia.
Las mitocondrias despolarizadas o inactivas tienen un potencial de membrana reducido, no retienen TMRE y muestran una señal de fluorescencia baja.
