Para realizar imágenes de células vivas del cerebro larvario del tercer estadio, comience recolectando los cerebros disecados y los cuerpos grasos aislados en el último pocillo de una placa de disección de tres pocillos que contiene la disección y el medio de imagen. Coloque una membrana permeable al gas en la parte posterior de un portaobjetos y presione el anillo dividido en el centro. Usando una micropipeta de 200 microlitros, transfiera hasta 10 cerebros disecados con el máximo posible de cuerpos grasos y 130 a 140 microlitros del medio al centro de la membrana.
Oriente los cerebros de acuerdo con la población de células madre neurales a obtener imágenes y el tipo de microscopio, asegurándose de que las muestras estén cerca del objetivo del microscopio. Por ejemplo, para obtener imágenes de las células madre neurales en los lóbulos centrales del cerebro, asegúrese de que los lóbulos cerebrales estén más cerca del objetivo. Luego, coloque suavemente un deslizamiento de cubierta de vidrio sobre la solución en la membrana para extender la solución con el cerebro y los cuerpos grasos a través de la membrana.
Sostenga el tejido de laboratorio en el borde de la cubierta para secar el exceso de solución hasta que los cerebros toquen el resbalón de la cubierta sin aplastarlo. A continuación, inmovilice el cubreobjetos aplicando vaselina fundida a lo largo de sus bordes con un pincel y permita que la gelatina se solidifique. Agregue 400 microlitros de medio de imagen a un pocillo en un micro portaobjetos de pocillos múltiples.
Transfiera los cuerpos grasos previamente diseccionados a este pozo. Luego, coloque hasta 10 cerebros en un grupo cerca del centro del pozo. Orientar los cerebros de acuerdo con la población de células madre neurales a obtener imágenes y el tipo de microscopio.
Permita que los cerebros se asienten en el pozo durante dos a cinco minutos. Cubra el microportaobjetos con la cubierta del portaobjetos antes de transferirlo al microscopio. Comience el proceso de adquisición utilizando la potencia láser y el tiempo de exposición más bajos para minimizar el blanqueo fotográfico.
Las imágenes de cerebros larvales que expresan Cherry-Jupiter impulsado por UAS y alfileres andróginos marcados GFP utilizando diapositivas de imágenes de múltiples pocillos y sin suplementos corporales de grasa revelaron que los alfileres formaron una media luna apical pronunciada en neuroblastos divisorios a los que los husos mitóticos se alinearon consistentemente durante la mitosis. En esas muestras, la duración del ciclo celular aumentó con el aumento del tiempo de imagen. Las muestras que se obtuvieron imágenes en un medio suplementado con cuerpo graso en un portaobjetos unido a la membrana no mostraron un aumento en la duración del ciclo celular.
Además, se observaron neuroblastos con cuatro divisiones en el portaobjetos unido a la membrana de 10 horas.
