Comience preparando todos los reactivos antes del experimento y descongele la matriz de la membrana basal en hielo. A continuación, prepare el medio monocapa murino. Diluir la membrana basal descongelada de uno a 20 con el medio monocapa murino frío y mantenerla en hielo.
Coloque un inserto de cultivo celular transparente de 0,4 micrómetros, utilizando pinzas estériles, en un solo pocillo de una placa de cultivo de tejido de 24 pocillos. Tome una punta de esquina del inserto y transfiérala al pozo. Repita hasta que se disponga del número adecuado de insertos de cultivo celular para el cultivo.
Para cubrir la superficie apical de cada inserto de cultivo celular con matriz de membrana basal diluida, coloque la punta de la pipeta P 200 en el centro del inserto y expulse la matriz de 150 microlitros. Luego, transfiera la placa a una incubadora estéril a 37 grados con 5% de dióxido de carbono, durante al menos una hora. Al final de la incubación, gire la placa de 24 pocillos en un ángulo de 45 grados.
Coloque un solo dedo en la esquina de la punta para estabilizar el inserto. Coloque suavemente la punta de pipeta P 200 a lo largo de la parte inferior del inserto y retire la matriz del sótano. Eliminar cualquier exceso de residuo lavando cada inserto de cultivo celular con 150 microlitros de DPBS estéril sin iones de calcio o magnesio y dejar secar en una cabina de seguridad biológica durante un mínimo de 10 minutos.
Una vez que los insertos estén secos, agregue 400 microlitros del medio monocapa murino hasta el fondo y 75 microlitros sobre el inserto de cultivo celular. Repita hasta que todos los insertos de cultivo celular estén sumergidos. Deje la placa en el gabinete de seguridad biológica o en la incubadora hasta que la necesite.
A continuación, retire la placa de 24 pocillos de colonoides intestinales maduros de la incubadora y colóquela debajo del gabinete de seguridad biológica. Aspire el medio con puntas estériles y lave cada pocillo con un mililitro de DPBS estéril a temperatura ambiente. Con puntas estériles, retire el DPBS sin iones de calcio o magnesio.
Digiera cada tapón de la matriz de la membrana basal agregando 500 microlitros de reactivo de disociación enzimática en cada pocillo a pasar. Para romper el tapón, gire la placa de 24 pocillos en un ángulo de 45 grados. Coloque la punta de la pipeta en el borde del tapón y despájela suavemente pipeteando cada tapón aproximadamente de seis a 10 veces.
Vuelva a colocar la placa de 24 pocillos en una incubadora estéril a 37 grados con 5% de dióxido de carbono, durante tres o cuatro minutos. Después de la incubación, pipetee la tripsina hacia arriba y hacia abajo de cinco a siete veces para cada pocillo bajo una cabina de seguridad biológica. Transfiera los colonoides disociados de cada pocillo a un tubo cónico estéril de 15 mililitros y lleve hasta un volumen de 10 mililitros con un medio de lavado de ratón helado.
A continuación, centrifugar los colonoides parcialmente digeridos a 300 g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados en una centrífuga de cubo oscilante. Debajo de la cabina de seguridad biológica, retire el sobrenadante del gránulo con una pipeta de 10 mililitros. Además, elimine cualquier medio restante con una pipeta P 200.
A continuación, vuelva a suspender el gránulo de colonoide añadiendo 75 microlitros de medio monocapa murino. Dispense 75 microlitros de la suspensión colonoide en el centro de cada inserto de cultivo celular. Pipetee suavemente la suspensión una o dos veces antes de agregarla al pocillo para asegurar un recubrimiento uniforme.
Coloque la placa de 24 pocillos con insertos de cultivo celular en una plataforma giratoria durante 10 minutos para permitir una dispersión uniforme a través del inserto de cultivo celular, antes de colocar la placa en una incubadora estéril de dióxido de carbono al 5% a 37 grados Celsius. Al final de la incubación, se desprendieron los fragmentos de colonoides sueltos colocando la punta junto al interior del cultivo celular y pipeteando el medio de tres a cinco veces con una pipeta P 200. Evite alterar las células intestinales adheridas.
Retire inmediatamente la mezcla de medio y colonoide. Repita hasta que se hayan limpiado todos los insertos de cultivo celular. Ahora agregue 150 microlitros de medio monocapa murino precalentado al lado apical de cada inserto de cultivo celular.
Agregue 400 microlitros de medio monocapa murino calentado a cada pocillo de una nueva placa de 24 pocillos. Transfiera el inserto de cultivo celular a la nueva placa agarrando su punta con pinzas estériles. Cambie el medio cada dos días hasta lograr la confluencia deseada.
Los colonoides enzimáticamente alterados en los insertos de cultivo celular aparecieron inicialmente en grupos celulares que oscilaban entre 15 y 150 células. Al tercer día, las células se aplanaron y cubrieron lentamente el inserto de cultivo celular, alcanzando generalmente la confluencia. Durante los dos días siguientes, las monocapas continuaron creciendo y formaron una barrera continua que se puede medir cuantitativamente.
