Colocar los ovocitos de vesícula germinal control y tratados con etopósido, o GV, en diferentes placas de cultivo de tejidos de plástico con tampón PFA-Tx 100 durante 40 minutos a temperatura ambiente. Enjuague los ovocitos en tres tampones de lavado distintos de 50 microlitros a temperatura ambiente y colóquelos en 25 microlitros de tampón de bloqueo en un bloque caliente durante una hora. A continuación, prepare el anticuerpo primario que reconoce gamma H2AX.
Diluir el anticuerpo primario con el tampón de bloqueo en una proporción de uno a 200 y sumergir los ovocitos en gotas de 15 microlitros a cuatro grados centígrados durante la noche. Lavar los ovocitos en tres tampones de lavado diferentes de 50 microlitros. Prepare el anticuerpo secundario anti-conejo de crecimiento conjugado Alexa Fluor 488.
Después de diluirlo con el tampón de bloqueo, sumergir los ovocitos en gotas de 15 microlitros del anticuerpo durante una hora en un bloque caliente a 37 grados centígrados protegido de la luz. Tome un colorante de ADN fluorescente de color rojo lejano DRAQ7 y transfiera los ovocitos a él durante 10 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad antes de lavarlos con tres tampones de lavado diferentes. Agregue pequeñas gotas de tampón de lavado a los ovocitos en una placa de Petri con fondo de vidrio de 35 milímetros para microscopía confocal.
Encienda el controlador láser y los láseres en el sistema confocal. Después de encender el controlador del microscopio y las lámparas, abra el software confocal y elija la lente de aceite 40X. Coloque la placa con los ovocitos en el portamuestras e intente enfocarse en los ovocitos moviendo la platina en los ejes X, Y y Z con el joystick.
Ajuste la potencia del láser, la ganancia y el tamaño del agujero de alfiler de forma independiente para cada experimento para minimizar la saturación. Para cada ovocito, establezca el área de interés específicamente en el núcleo en el área de ADN. Defina los bordes del área de ADN y ajuste el tamaño del paso Z a tres micrómetros.
A continuación, inicie el escaneo. Guarde las imágenes de cada celda de la carpeta seleccionada. Abra el software ImageJ y haga clic en la imagen, seguida del color y los canales divididos.
Para dividir todos los canales. Haga clic en la tabla de búsqueda y elija los colores preferidos para cada canal Haga clic en imagen, color y fusionar canales para fusionar los canales de gamma H2AX y ADN. En los ovocitos del nucléolo rodeados con altos niveles de daño en el ADN, haga clic en la imagen, pilas, proyecto Z y, con el comando de selecciones a mano alzada, seleccione toda el área de ADN.
Haga clic en analizar, seguido de medir para medir la fluorescencia gamma H2AX y copie las mediciones en un archivo de Excel. En esta figura se muestra la fluorescencia gamma H2AX en los ovocitos en estadio GV del nucléolo rodeado cero horas después del tratamiento con etopósido. La gamma H2AX aumenta inmediatamente después de la exposición en todas las concentraciones de etopósido, y el aumento depende de la concentración.
Aquí se muestra la fluorescencia gamma H2AX en los ovocitos en estadio GV del nucléolo rodeado 20 horas después del tratamiento con etopósido. Gamma H2AX reduce 20 horas después de la exposición todas las concentraciones de etopósido. Después de una parada prolongada de la profase, los ovocitos en estadio GV mostraron la capacidad de reducir el número y la intensidad de los focos gamma H2AX, lo que implica la presencia de procesos de reparación activa en los ovocitos detenidos en estadio GV.
