Para comenzar el ensayo utilizando el agonista del receptor de plaquetas, péptido relacionado con el colágeno reticulado o CRPXL, diluya una cantidad adecuada del stock de CRPXL en el tampón del ensayo a una concentración adecuada para inducir la máxima agregación plaquetaria. A partir de ahora, la solución resultante se denominará estándar. A continuación, a partir de las mismas concentraciones preparadas más altas, realice secuencialmente diluciones en serie dobles tanto para el reactivo patrón como para el reactivo de ensayo.
Prepare una serie de diluciones de seis a ocho puntos tanto para la prueba como para el patrón en el tampón de ensayo que genere respuestas de agregación desde el 100 % hasta el 0 %Cuando el plasma rico en plaquetas, o PRP, esté listo para usar, agregue una alícuota de PRP en la cubeta de agregametría de transmisión de luz. Deje que las muestras se calienten a 37 grados centígrados en los pocillos de retención durante un par de minutos. Una vez que se hayan calentado adecuadamente, coloque las cubetas en el agregador para comenzar a registrar las trazas.
Con agitación constante, agregue el agonista y registre los datos. Realice la recopilación de datos para cada dilución preparada del patrón y el reactivo de prueba. Utilice Graphpad Prism, o cualquier paquete de software adecuado, para comprobar que las curvas de concentración para el patrón y la prueba son paralelas.
Introduzca los datos de forma que el eje x contenga las concentraciones y el eje y contenga las respuestas indicadas por el porcentaje de agregación máxima o el área bajo la curva. A continuación, transforme los valores de concentración en los logaritmos correspondientes, o concentración logarítmica. Seleccione la regresión no lineal de las funciones de análisis y utilice la ecuación para la estimulación de la respuesta a la dosis.
Seleccione el agonista logarítmico frente a la pendiente de la variable de respuesta y utilice un ajuste de tres o cuatro vías, en función de cuál sea el mejor para los datos. Determine si las curvas generadas son paralelas haciendo clic en la pestaña de comparación y comparando los datasets. Asegúrese de que la pendiente y las asíntotas de la prueba, así como las curvas estándar, sean equivalentes.
Si se cumplen estas condiciones, se procede a calcular la potencia, o EC50, utilizando el ajuste de la curva de regresión no lineal. Calcule la potencia relativa dividiendo el valor EC50 del patrón por el de la prueba. Ajuste la masa por concentración de volumen del reactivo de prueba para tener en cuenta la diferencia de potencia con respecto al patrón.
Las trazas de agregación plaquetaria para el patrón y el reactivo de prueba revelaron la diferencia entre las dos respuestas de agregación. A 0,075 microgramos por mililitro, hubo una clara respuesta al estándar, mientras que, para la prueba, la concentración correspondiente no mostró respuesta. Los valores de CE50 del reactivo patrón y del reactivo de prueba se calcularon trazando la curva de respuesta a la concentración.
