Comience centrifugando la suspensión de células neuronales murinas-puras a 300 G durante ocho minutos. Aspirar suavemente el sobrenadante y resuspender el gránulo en 80 microlitros de HBSS con solución 0,5 BSA. Después de agregar el anticuerpo específico, incubar los tubos a cuatro grados centígrados durante 10 minutos.
Lave el exceso de anticuerpos con una solución HBSS-BSA y centrifugue. Añadir 20 microlitros de microperlas de antibiotina al pellet, resuspendido en HBSS-BSA. Incubar el tubo a cuatro grados centígrados durante 10 minutos.
A continuación, agregue 0,5 mililitros de HBSS con una solución de BSA al 0,5% por cada 10 a las siete células. Enjuague la columna con 0,5 mililitros de HBSS con una solución de BSA al 0,5%. Una vez que se detenga el goteo, coloque un tubo de 15 mililitros debajo de la columna y pase 0,5 mililitros de suspensión celular a través de él.
Recoja el eluido que contiene células neuronales inespecíficas, luego limpie la columna con tres lavados de 0,5 mililitros de HBSS con 0,5% de BSA. Ahora retire la columna del imán y colóquela en un nuevo tubo de 15 mililitros. Agregue un mililitro de HBSS con 0.5% de BSA y use el émbolo para eliminar las células objetivo.
Después de la centrifugación y la aspiración del sobrenadante, vuelva a suspender el gránulo en 0,5 mililitros de medio de recubrimiento. Cuente las células en una cámara de recuento de Neubauer bajo un microscopio de campo claro. Coloque las células objetivo como control positivo y las células no específicas como control negativo en la placa de 24 pocillos preparada.
Incubar a 37 grados centígrados durante 12 horas. Las neuronas LepR positivas comenzaron a formar neuritas después de 48 horas. En DIV4, las extensiones axonales mostraron avances, mientras que los procesos dendríticos comenzaron a aparecer.
En DIV6, las neuronas estaban suficientemente desarrolladas. Los estudios inmunofluorescentes mostraron que no se observaron células gliales u otras células no neuronales. La naturaleza neuronal de las células se confirmó mediante la tinción de la proteína 2 asociada a microtúbulos.
En DIV10, el 30% de las células LepR positivas expresaron POMC. La conectividad y funcionalidad sináptica se observaron en cultivos generales que contenían poblaciones neuronales hipotámicas heterogéneas.
